HPLC法测定人血浆中的拉莫三嗪

李 琪,雷力力,张志国,汪凤山

(佳木斯大学附属第一医院药剂科,黑龙江 佳木斯 154003)

拉莫三嗪(lamotrigine,LTG)为苯三嗪类的新一代广谱抗癫痫药。2005年在我国上市,拉莫三嗪(LTG)主要经过肝脏代谢,LTG血药浓度＞15mg/L时,毒性反应的几率会增加;治疗难治性癫痫时,有效浓度在3～ 14mg/L;5～ 13mg/L时,出现副反应缓慢;13～ 14mg/L时副反应发生几率剧增。肝酶诱导剂如卡马西平、苯妥英钠可加速拉莫三嗪的代谢;肝酶抑制剂如丙戊酸钠(V PA)可减缓拉莫三嗪的代谢。由于该药与其它抗癫痫药在药动学上存在的这种相互作用,导致了个体间的血药浓度差异较大[1],因此在临床中有必要对拉莫三嗪进行血药浓度监测[2～4],本文采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法测定血浆中拉莫三嗪药物浓度,以艾司唑仑为内标溶液,乙腈-磷酸缓冲液为流动相,酸性条件下用乙酸乙酯作萃取剂,测定拉莫三嗪的血药浓度,结果表明该方法简便、灵敏、准确、重现性好,可用于拉莫三嗪的血药浓度监测。

1 材料

1.1 仪器

大连依利特 P230Ⅱ高效液相色谱仪,UV230Ⅱ紫外-可见检测器,EC2006色谱数据处理工作站。XW-80涡旋混合器(上海精科实业有限公司);AUW220D十万分之一分析天平(日本岛津公司)。

1.2 试药

____拉莫三嗪 (中国药品生物制品检定所,批号:100775-200401),艾司唑仑(中国药品生物制品检定所,批号:1219-0102);甲醇、乙腈、乙酸乙酯为色谱纯;磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色 谱柱:Hypersil ODS2(250mm× 4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.05%磷酸 (36：64);流速:1.0mL˙min-1;柱温:35℃;检测波长:230 nm;进样量:20μL。在该色谱条件下,拉莫三嗪和艾司唑仑的保留时间分别为6.33min,9.29min,峰形良好。血浆中的内源性物质不影响拉莫三嗪的测定。色谱见图 1。

图1 高效液相色谱图

2.2 标准溶液和内标溶液的制备

准确称取拉莫三嗪对照品19mg,溶解于甲醇并定容至50mL,得拉莫三嗪标准贮备液。精密量取上述贮备液5mL,加甲醇至50mL,得 0.038 μg/mL的 LTG标准溶液。准确称取艾司唑仑对照品24.8mg,溶解于甲醇并定容至100mL,得LTG标准贮备液。精密量取上述贮备液5mL,加甲醇至50mL,得0.0248mg/mL的艾司唑仑内标溶液。

2.3 血样处理

精密吸取健康人血浆200μL,置10mL玻璃试管内,加入0.0248mg/mL艾司唑仑标准液25μL,0.038mg/mL拉莫三嗪标准溶液20μL,漩涡混匀,加乙酸乙酯4mL,旋涡混匀3min,3500r/mim离心10min,分取乙酸乙酯层 3mL于10mL试管内 ,于45℃下 N2气流吹干 ,加 200μL甲醇溶解,作为样品溶液。

2.4 标准曲线的制备

取血浆200μL,加入不同浓度的拉莫三嗪标准溶液20 μL,配成浓度为 0.95、 1.9、 3.8、7.6、19、 38μg˙mL-1血样 ,按“2.3”项下方法处理血样,进样测定拉莫三嗪的峰面积,以拉莫三嗪浓度(X)对峰面积(Y)作线性回归,得回归方程为:Y=0.132x-0.0429(r= 0.9991,n=6)。结果表明 ,拉莫三嗪血药浓度在0.95～ 38 μg˙mL-1范围内线性关系良好。拉莫三嗪的定量限为 0.95μg˙mL-1。

2.5 精密度及回收率试验

按样品溶液的制备方法,取拉莫三嗪标准溶液,稀释为0.95、3.8、6.65 μg/mL三种浓度的样品各 5份 ,按色谱条件进样检测,以内标法计算回收率;另同法配制三种浓度样品各1份,按色谱条件进样检测(同日不同时间进样5次 ,以及在三日内进样5次),以样品及内标峰面积比值计算日内及日间精密度。加样回收率及日内、日间精密度试验结果见表1。

表1 回收率与精密度试验结果 ±s,n=5)

表1 回收率与精密度试验结果 ±s,n=5)

对照品 加入量μ g˙mL-1 检出量μ g˙mL-1 回收率(%) RSD% 日内 RSD% 日间 RSD%拉莫三嗪 0.950.9911±0.0225104.322.162.076.823.803.8872±0.0161102.291.571.974.416.656.6348±0.024199.772.421.353.04

2.6 重复性试验

按样品溶液制备方法制备样品8份,按色谱条件进样检测,测定拉莫三嗪的血药浓度,含量的 RSD=1.89%,说明本法的重复性良好。

2.7 稳定性试验

用空白血浆制备含拉莫三嗪 0.95、3.8、6.65μg/mL三种浓度的样品 ,室温放置 ,分别于 0h、 2h、4h、 8h、 16h、 24h、36h、48h取样,按样品溶液制备方法处理,并测定。24h内的稳定性的 RSD为 5.6%,24～ 48h内稳定性的 RSD为15.4%。说明 24h较为稳定,建议配置完成后在24h内测定。

3 讨论

国内外已有报道采用可以安定类药物[5,6]作为内标物,艾司唑仑具有合适的保留时间 ,性质稳定,价格低廉,满足作为内标物的要求。且艾司唑仑的峰位又不与内源性物质及拉莫三嗪的峰位重叠,故选择艾司唑仑作为测定拉莫三嗪含量的内标物。本研究在190～400nm波长范围内对拉莫三嗪进行紫外扫描 ,在 205、215、220、225、230、240nm 波长处均有吸收峰,215nm波长处拉莫三嗪有最大吸收峰,而在230nm波长处,艾司唑仑峰形较好。为了兼顾艾司唑仑的含量测定。选用230nm波长来测定。在对萃取剂的选择时 ,正己烷、二氯甲烷等的效果均不是很好。采用乙酸乙酯直接提取血浆样品,效果较好,操作简便,提取后样品中杂质较少。可以达到试验要求。流动相的 PH值对峰形、峰位都有些影响,所以流动相的选择用乙腈-0.05%磷酸(36:64),加入磷酸缓冲液可以调整峰形,达到较好的分离效果。因此,采用 RP-HPLC法测定 LTG血药浓度,操作简便、快速、灵敏、重复性好、回收率及精密度高,可用于拉莫三嗪的治疗药物监测。

[1] 宋志彬,廖卫平,杨少青,等.拉莫三嗪临床药物代谢动力学及其药物相互作用研究[J].中华神经科杂志,2005,38(8):517

[2] 刘颖,王丽,何大可.RP-HPLC法同时测定卡马西平、拉莫三嗪、苯巴比妥、苯妥英钠及环氧卡马西平的血清浓度 [J].中国 临床药理学与治疗学,2005,10(8):846

[3] 张坤,王丽,刘颖.癫痫儿童拉莫三嗪血清与血清浓度的相关性[J].中国临床药理学与治疗学,2006,11(9):978

[4] 何大可,王 丽,王寅初.反相高效液相色谱法同时测定拉莫三嗪和卡马西平血药浓度[J].药物分析杂志,2006,26(2):212

[5] levert H,Odou P,Robert H.LC determination of omcarbazepine and its active metabolite in human serum[J].J Pharm Biomed Anal,2002,28(3-4):517-525

[6] 胡国新,邱相君,周红宇.反相高效液相色谱法测定奥卡西平活性代谢产物及其在健康人体的药动学特征 [J].中国临床药理学杂志,2005,21(3):209-212