青藤碱干预多柔比星肾病大鼠的实验研究

王丽敏,王丽娜,李春玉,邹艳红,王海燕

(佳木斯大学附属第一医院儿科,黑龙江 佳木斯 154003)

MCNS是小儿肾病综合征最常见的类型,其病因与发病机制目前尚未完全明确。IL-6是参与炎症反应和免疫调节的重要细胞因子之一[1]。现有资料已证实,肾脏系膜细胞、内皮细胞及肾小管上皮细胞均能分泌 IL-6,IL-6可以通过旁分泌和自分泌两种形式与肾小球系膜细胞上的 IL-6受体结合,促进肾脏系膜细胞增多和基质增生,进而使肾小球滤过膜增厚[2],最终导致肾小球硬化[3]。作为一种免疫抑制剂 SIN主要用于治疗风湿性疾病,据文献报道 SIN亦有减少蛋白尿,降低血中循环免疫复合物,减轻肾小球炎症反应等肾脏保护作用。本实验通过制备大鼠多柔比星肾病模型来模拟人类 MCNS,检测 IL-6在 MCNS大鼠中的异常表达情况及SIN对其的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组

雄性 Wistar大鼠 120只 ,清 洁级 ,体重 90～ 120g,由 佳木斯大学动物实验中心提供。随机分为正常组32只、肾病组88只。根据王峥等[4]的方法给予肾病组单次尾静脉注射多柔比星5mg/kg,制备大鼠多柔比星肾病模型.正常组给予注射等量生理盐水。4只不合格者剔除。将模型成功的肾病大鼠随机分成两组:肾病对照组 44只、治疗组 40只。治疗组给予SIN36mg/kg.d灌胃,肾病对照组及正常组给予等量生理盐水灌胃 ,实验第 7d开始给药,共 5w。实验第 7、14、28、42天检测各组大鼠24 h尿蛋白定量,同时采用 ELISA法检测各组大鼠尿及肾组织中 IL-6水平。

1.2 方法

1.2.124 h尿蛋白测定:采用考马斯亮蓝法检测24h尿蛋白定量。

1.2.2 尿 IL-6水平测定:于实验第 7、14、28、42天收集各组大鼠晨尿,2000r/min离心15min,取上清液2mL,均置于-20℃冰箱保存待检。

1.2.3 肾组织中 IL-6检测:于实验第 7、 14、 28、 42天分批处死大鼠,剖腹取肾,将肾组织匀浆后 2000r/min离心 15min,取上清液 2mL,均置于-20℃冰箱保存。IL-6检测均采用ELISA法。试剂盒购于武汉博士德生物公司,结果以 pg/mL表示。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组大鼠24h尿蛋白定量比较

见表1。

表1 各组大鼠不同时期尿蛋白定量比较 ±s,mg/24h)

表1 各组大鼠不同时期尿蛋白定量比较 ±s,mg/24h)

*与正常组比较 P＜0.01;△与肾病组比较 P＜0.01。

正常组 86.31± 1.296.14± 1.236.25± 1.226.53± 1.15肾病组 1142.11± 5.11* 121.79± 8.29* 202.76± 12.14* 265.61± 17.74*治疗组 1041.33± 5.3097.33± 6.84△ 162.66± 10.80△ 111.87± 9.91△F值 179.99 792.30 979.12 1042.43

2.2 各组大鼠不同时期尿液中 IL-6水平比较

见表2。

表2 各组大鼠不同时期尿 IL-6水平比较 ±s,pg/mL)

表2 各组大鼠不同时期尿 IL-6水平比较 ±s,pg/mL)

*与正常组比较 P＜0.01;△与肾病组比较 P＜0.01。

正常组 811.37± 1.9811.76± 1.8312.02± 2.2111.63± 1.83肾病组 1121.29± 4.42* 27.72± 5.11* 37.28± 4.51* 48.55± 4.41*治疗组 1020.73± 3.7222.29±3.97△ 28.97± 4.71△ 25.69±3.92△F值 20.27 36.27 88.77 243.56

2.3 各组大鼠不同时期肾组织中 IL-6水平比较

见表3。

表3 各组大鼠不同时期肾组织中 IL-6水平比较 ±s,pg/mL)

表3 各组大鼠不同时期肾组织中 IL-6水平比较 ±s,pg/mL)

*与正常组比较 P＜0.01;△与肾病组比较 P＜0.01。

正常组 889.67± 9.8088.81± 9.9390.51± 8.6789.64± 9.47肾病组 11124.86± 9.87* 186.41± 13.98* 233.79± 15.21* 292.72± 17.04*治疗组 10124.82± 9.06144.13± 10.31△ 185.27± 11.05△ 154.75± 9.04△F值 39.04 159.35 316.88 636.97

2.4 相关分析

肾病组24h尿蛋白定量与尿液中 IL-6的表达水平呈正相关 (R=0.794,P＜0.01)。24h尿蛋白定量与肾组织中 IL-6的表达水平呈正相关 (R= 0.870,P ＜0.01)。肾组织中IL- 6与 尿中 IL-6的表 达呈正 相关 (R= 0.739,P＜0.01)。

3 讨论

IL-6是一种具有多种生物学活性的细胞因子,作为机体复杂的细胞因子家族中的重要成员,在多种疾病的发生发展中起着非常关键的作用。徐佳[5]等的研究表明 IL-6在病理模型组中主要在肾小管上皮细胞和细胞核有表达,在肾小球内亦可见阳性表达。PNS患儿尿中 IL-6显著高于健康儿童,且尿中 IL-6活性增高并不是由于外周血淋巴细胞分泌IL-6增强所致 ,因此检测患儿尿 IL-6的水平能更好地反映患儿病情与治疗效果,对指导临床治疗具有重要意义[6]。研究发现 N S组 IL-6水平明显高于N S缓解组及正常对照组,而 NS缓解组 IL-6水平接近正常,提示在 NS病中存在以IL-6增高为特征性的免疫学紊乱[7]。本实验结果显示肾病组在注射多柔比星7d后尿中 IL-6的表达逐渐升高 ,42d达到高峰,24h蛋白尿定量在各时期表达情况与正常组相比均有显著性差异 (P＜0.01),尿液及肾组织中 IL-6的表达情况与24h蛋白尿量均呈正相关 (P＜0.01),且尿液中 IL-6与肾组织中 IL-6的表达也呈正相关 (P＜0.01)。治疗组尿液、肾组织中 IL-6及尿蛋白也不同程度的增加,但与肾病组相比较低。目前已证实,肾脏系膜细胞、肾小球上皮细胞和间质细胞等均能产生 IL-6,且 IL-6在肾脏局部又能刺激系膜细胞增殖并分泌其他细胞因子和胶原等进而影响疾病发展。病理情况下,以上细胞产生的 IL-6增多,参与肾脏病理生理过程,并从尿中排出。这也很好的解释了在尿 IL-6增高的 MCN S患者中,大量蛋白尿的发生率较高 ,肾脏病理改变较重的原因。研究发现[8]经青藤碱干预后,IL-6表达明显下降,减轻了过量 IL-6表达对免疫系统的损害,从而提高了巨噬细胞的免疫应答能力有关。这与本实验的研究结果一致。本实验建立的动物模型较好地模拟了人类 MCNS,同时发现了 IL-6表达的动态变化规律及其与蛋白尿的关系。本研究发现尿液及肾组织中 IL-6与 24h蛋白尿呈正相关,尿液中IL-6与肾组织中 IL-6的表达呈正相关,故尿液中 IL-6的水平可以反映出肾组织中 IL-6的水平。而 SIN能有效的抑制肾组织及尿中 IL-6的表达 ,减轻 MCNS大鼠尿蛋白、保护肾功能,促进肾脏病理损害的修复。

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[3] Moura IC,Benhamou M,Launay P,et al.The glomerular response to Ig A deposition in IgA nephropathy[J].Semin Nephrol,2008,28(1):88-95

[4] 王峥,王增贵,刘震,等.多柔比星诱发大鼠肾病模型的实验研究[J].华西医科大学学报,1990,21(4):430-432

[5] 徐佳 ,崔蕊.Ig A-I号治疗 IgA肾病肾组织 IL-1 β,IL-6检测分析 [J].黑龙江医学,2008,9(32):663-664

[6] 陈英,高岩.白细胞介素在小儿原发性肾病综合征发病机制中作用的研究现状[J].医学综述,2008,14(6):908-911

[7] 刘雪梅,张洪霞,段春红.肾病综合征患儿免疫功能测定的临床意义[J].中国实用医药,2008,3(33):17-18

[8] 邹同祥,张翼冠,张海港.青藤碱对巨噬细胞吞噬能力的影响及机制探讨 [J].中药药理与临床,2008,24(6):15-16