蒲地蓝消炎颗粒微生物限度检查及有效性验证试验研究*

田桂英

(天津市药品检验所，天津 300070)

蒲地蓝消炎颗粒为固体口服给药制剂，功能为清热解毒，抗炎消肿。临床上用于治疗疖肿、咽炎、扁桃腺炎等。但其对细菌有抑菌作用，为了保证微生物限度检查结果的真实可靠，应消除其抑菌性，以保证药品受微生物污染的程度被检出。本实验建立了蒲地蓝消炎颗粒微生物限度检查方法，并根据《中国药典》要求进行了方法学验证试验，验证试验结果符合《中国药典》2010年版二部附录微生物限度检查法的要求。

1 仪器和试药

培养基：营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、胆盐乳糖培养基、4-甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)、胆盐乳糖发酵培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基。菌种：大肠埃希菌(Escherichia coli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) [CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) [CMCC(B)63501]、白色念珠菌(Candida albicans) [CMCC(B)98001]、黑曲霉(Aspergillus niger) [CMCC(B)98003]，上述菌种均购自中国生物制品检定所，由本所传代，保存，本试验所用菌种均为第3代。新鲜配制的0.9%无菌氯化钠溶液、pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液。薄膜过滤装置：美国whatman薄膜过滤器。蒲地蓝消炎颗粒(天津隆顺榕制药厂，批号070304、 070306 、070308)。

2 方法和结果

2.1《中国药典》方法 鉴于日常工作中已知蒲地蓝消炎片对细菌有抑制作用，故先采用常规法和稀释法同步进行了本品细菌计数的方法学验证试验。霉菌和酵母菌计数按常规法进行。

2.1.1菌液制备 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，35 ℃培养18 h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，25 ℃培养24～48 h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，25 ℃培养5～7 d，加入4 ml 0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，每制成1 ml含孢子数为50～100 cfu的孢子悬液。

2.1.2细菌计数

2.1.2.1供试品的制备 取本品10 g，加pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液至100 ml，分散均匀，作为1∶10的供试液，常规法每皿取供试液1 ml，稀释法取供试液1 ml，等量分注5个平皿中，每皿0.2 ml。

2.1.2.2试验组 取1∶10的供试液1和0.2 ml分别注入平皿中，再分别加入规定量的阳性对照菌(约50～100 cfu)，倾注营养琼脂培养基。

2.1.2.3菌液组 取规定量的上述阳性对照菌(约50～100 cfu)，分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基。

2.1.2.4供试品对照组 取1∶10的供试液1 和0.2 ml分别注入平皿中，倾注营养琼脂培养基。

2.1.3霉菌和酵母菌计数

2.1.3.1试验组 取上述1∶10的供试液1 ml置平皿中，同时在每皿中加入规定量的试验菌(约50～100 cfu )，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基。

2.1.3.2菌液组 取规定量的试验菌(约50～100 cfu )于平皿中,倾注玫瑰红钠琼脂培养基。

2.1.3.3供试品组 同试验组供试品处理，不加试验菌。

2.1.4结果 本品采用常规法和培养基稀释法进行细菌计数的方法学验证试验，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌试验组的回收率均低于70%；采用常规法进行霉菌和酵母菌计数的方法学验证试验，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%。表明本品对细菌有较强的抑制作用，常规法和培养基稀释法都不能消除其抑菌性，但对霉菌和酵母菌无抑制作用，霉菌和酵母菌计数可按常规法进行，见表1。

表1 常规法和稀释法试验结果

2.2离心沉淀联合薄膜过滤法进行细菌计数的验证试验

2.2.1试验组 取本品10 g，加pH7.0的氯化钠蛋白胨缓冲液至100 ml，取10 ml置离心管中，先以500 r/min离心3 min，取上清液1 ml薄膜过滤，用pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml分次冲洗，并在最后一次冲洗液中加入约50～100 cfu的试验菌，取膜贴于营养琼脂培养基上。

2.2.2菌液组 取规定量的试验菌(约50～100 cfu)，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，按平皿法测定其菌数。

2.2.3供试品对照组 同试验组供试品处理，不加试验菌。

2.2.4稀释剂对照组 取规定量的试验菌(约50～100 cfu )，同供试品处理后，薄膜过滤，用200 ml pH 7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲液分次冲洗后，取膜贴于营养琼脂培养基上。

2.2.5结果 大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌试验组的回收率均大于70%，见表2，结果表明离心沉淀联合薄膜过滤法能较好的消除本品对细菌的抑制作用。

2.3控制菌检查方法的验证

2.3.1菌液制备 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的新鲜培养物接种于营养肉汤培养基中，35 ℃培养18 h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1 ml含菌数为50～100 cfu的菌悬液。

2.3.2大肠埃希菌验证方法

2．3.2.1试验组 取上述1∶10的供试液10 ml和规定量的大肠埃希菌(约50～100 cfu)加入100 ml的胆盐乳糖培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。

2.3.2.2阴性菌对照组 取1∶10的供试液10 ml和规定量的金黄色葡萄球菌(约50～100 cfu)加入100 ml的胆盐乳糖培养基中，依法检查。

2.3.2.3阳性对照组 取规定量的大肠埃希菌(约50～100 cfu)加入100 ml的胆盐乳糖培养基中，依法检查。

2.3.2.4供试品对照组 取1∶10的供试液10 ml置100 ml的胆盐乳糖培养基中，依法检查。

取试验组、阴性菌对照组、阳性对照组、供试品对照组上述培养物各0.2 ml，分别接种于含5 ml MUG培养基的试管内，培养，分别于5和24 h在366 nm紫外光下检视，试验组管MUG阳性，靛基质阳性；阴性菌对照组管MUG阴性，靛基质阴性；阳性菌对照组管MUG阳性，靛基质阳性。

2．3.2.5试验结果 阳性对照组检出大肠埃希菌，阴性菌对照组未检出大肠埃希菌，试验组检出大肠埃希菌。验证结果符合要求。见表3。

表3 大肠埃希菌验证结果

2.3.3大肠菌群验证方法

2.3.3.1试验组 取上述1∶10的供试液1 ml和规定量的大肠埃希菌(约50～100 cfu)加入10 ml的胆盐乳糖发酵培养基中，35 ℃培养18～24 h。

2.3.3.2阴性菌对照组 取1∶10的供试液1 ml和规定量的金黄色葡萄球菌(约50～100 cfu)加入10 ml的胆盐乳糖发酵培养基中，35 ℃培养18～24 h。

2.3.3.3阳性对照组 取规定量的大肠埃希菌(约50～100 cfu)加入10 ml的胆盐乳糖培养基中，35 ℃培养18～24 h。

2.3.3.4供试品对照组 取1∶10的供试液10 ml置100 ml的胆盐乳糖培养基中，依法检查。

2.3.3.5试验结果 试验组管和阳性对照组管均有菌生长且产酸产气，均检出大肠菌群。阴性菌对照组管和供试品对照组管无菌生长，且不产酸产气，未检出大肠菌群。验证结果符合药典要求，见表4。

表4 大肠菌群验证结果

3 讨论

微生物污染的监控是药品安全性评价的重要手段，中成药制剂大多是多种中药成分经煎煮、提取、浓缩而成，其中某一种成分在试验条件下如果有抑菌作用则干扰整个制剂的微生物检验结果。中成药制剂中通常含有具有一定抑菌作用的药物,如牛黄、大黄、黄芩、黄柏、穿心莲、三七等,这些药物在处方中由于剂量的大小及来源质量的差异,决定了它们在制剂中抑菌作用的强弱。而且具有抑菌作用的中成药制剂大多是对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抑菌作用。只有采用适当的方法去除制剂的抑菌作用，使之不影响微生物的检查结果，同其他的分析方法一样，证明所采用的方法是适宜的，才能保证结果的真实性、客观性。

蒲地蓝消炎颗粒的主要成分有黄芩、蒲公英、板蓝根等，细菌计数先分别采用平皿法和培养基稀释法验证，霉菌和酵母菌计数按常规法验证，试验结果表明大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均低于70%，白色念珠菌、黑曲霉的回收率均大于70%，表明蒲地蓝消炎颗粒对细菌有较强的抑制作用，对霉菌和酵母菌无抑制作用，所以霉菌和酵母菌计数方法可以采用操作简单的常规法进行。本文针对蒲地蓝消炎颗粒对细菌的抑制作用，又采用了离心沉淀联合薄膜过滤法进行细菌计数的验证试验，结果上述3种菌的回收率均大于70%，能较好的消除其抑菌作用，说明该方法合理、有效、可行。