HPLCELSD法测定硫酸西索米星的含量*

刘海玲，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 300070)

硫酸西索米星为氨基糖苷类广谱抗生素，由于氨基糖苷类抗生素无特征紫外吸收，不能直接采用传统HPLC-UV法测定，采用衍生化方法测定试验结果影响因素多。《中国药典》2005年版二部采用抗生素微生物检定法进行含量测定[1],其操作烦琐、专属性差，并且影响因素多。蒸发光散射检测器(ELSD)为不含发色团化合物的分析提供了一种新的检测手段，其响应值与被测物质量成正比，不依赖于被测物质的光学性质[2]。近年来陆续有文献报道用蒸发光散射检测器进行氨基糖苷类抗生素的质量分析[3-6]。本实验采用高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)法对硫酸西索米星进行含量测定，方法灵敏度高、重现性和准确度好，可满足质量控制要求。

1 仪器与试药

岛津LC-10AT高效液相色谱仪，Alltech ELSD 2000ES型蒸发光散射检测器。西索米星标准品(中国药品生物制品检定所，批号0353-200001)；硫酸西索米星为江苏无锡山禾福祁制药有限公司(批号20070801、20071001和20071002)和江苏无锡第二制药厂(批号20070503)提供。试验用水为娃哈哈饮用纯净水；三氟乙酸为TEDIA公司产品。

2 方法与结果

2.1色谱条件及适用性试验

2.1.1色谱条件 色谱柱：CAPCELL PAK TYPE：ACR C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：0.3 mol/L三氟乙酸-甲醇-乙腈(96∶3∶1)；流速：0.5 ml/min；采用蒸发光散射检测器，漂移管温度：110 ℃，雾化气体流速：3.0 L/min。

2.1.2系统适用性试验 分别称取庆大霉素C1a和西索米星对照品适量，用水溶解并稀释制成每1 ml中含庆大霉素C1a0.1 mg和西索米星3 mg的溶液，作为分离度测试溶液①；称取西索米星对照品约50 mg，加0.5 ml过氧化氢溶液(浓过氧化氢溶液10→100)溶解，水浴45 min后立即取出，放冷至室温，加水稀释至10 ml，摇匀，作为分离度测试溶液②。照“2.1.1”项下色谱条件，分别精密量取分离度测试溶液①和②各20 μl注入液相色谱仪，记录色谱图。西索米星峰与庆大霉素C1a峰的分离度为1.2；在相对保留时间0.80～0.95处应能检测出三个氧化降解物。色谱图见图1。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备 取西索米星对照品适量，精密称定，分别加水溶解并定量稀释制成每1 ml中约含西索米星0.12、0.15和0.18 mg的溶液，作为对照品溶液①、②和③。

2.2.2供试品溶液的制备 取供试品适量，精密称定，用水溶解并定量稀释制成每1 ml中约含西索米星0.15 mg的溶液，即得。照“2.1.1”项下色谱条件，分别吸取对照品和供试品溶液各20 μl，色谱图见图2。

2.3线性关系考查 精密称取西索米星对照品11.60、18.22、22.89、27.87和34.47 mg，分别置100 ml量瓶内，加水溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密量取各溶液20 μl注入液相色谱仪，按“2.1.1”色谱条件，记录色谱图。以对照品进样量对数为横坐标，峰面积对数为纵坐标，求得回归方程：Y=1.602 7X+5.989 7(r=0.999 7)。结果表明西索米星进样量在1.271～3.778 μg范围内线性良好。

2.4重现性试验 采用测定浓度的80%、100%和120%三个浓度，每个浓度分别制备三份供试品溶液，分别依法测定，结果RSD为1.01%(n=9)，表明重现性良好。

1.西索米星 2.庆大霉素C1a

1．西索米星

2.5样品测定 采用本方法测定硫酸西索米星和采用抗生素微生物检定法[1]测定的结果见表1，二者结果基本相符。

表1 两种方法测定结果比较

3 讨论

3.1流动相的选择 氨基糖苷类抗生素极性较大，在ODS柱上不保留，可通过与挥发性酸形成离子对或采用碱性流动相使氨基糖苷类抗生素游离成碱，降低极性以增加在色谱柱上的保留[4]。 采用碱性条件[5]，试验了乙酸胺系统，试验结果表明，流动相为碱性时，西索米星色谱峰峰形不对称。 采用酸性条件，试验了五氟丙酸系统[6]，试验结果表明，随着五氟丙酸浓度的增大，主峰出峰时间较晚，峰形不对称。试验了三氟乙酸流动相系统[4]，随着流动相中三氟乙酸浓度的增加，西索米星色谱峰的保留时间减少，峰形改善。因此选择三氟乙酸作为流动相的离子对试剂对西索米星进行分析。

3.2蒸发光散射检测器条件的选择 考察漂移管温度分别为80、100、105、110和115 ℃时的分析情况，试验结果表明，漂移管的温度对检测结果影响不显著。分别考察载气流速为2.0、2.5、3.0和3.5 L/min 时的分析情况，试验结果表明随着载气流速的减小，峰面积增大，基线则越不稳定。综合试验结果，确定漂移管温度为110 ℃，载气流速为3.0 L/min。

3.3系统适用性试验的建立 试验中考查了一系列氨基糖苷类抗生素(庆大霉素、硫酸链霉素、小诺霉素、妥布霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星、依替米星、核糖霉素、新霉素、新霉胺和庆大霉素C1a等)在此色谱系统中的保留时间，庆大霉素C1a在西索米星主峰后被洗脱。

经过不同破坏条件试验筛选，仅氧化破坏可出现主峰前紧邻主峰的杂质峰，拟定供试品以过氧化氢溶液(浓过氧化氢溶液10→100)水浴破坏45 min，可检测到三个降解物的色谱峰。因此采用两个分离度测试溶液进行系统适用性控制。

3.4色谱柱粗放度试验 分别用CAPCELL PAK TYPE：ACR C18、Diamonsil C18和Agilent ZORBAX SB-C18三个品牌的(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，进行硫酸西索米星含量测定，色谱峰峰形均良好，系统适用性试验均符合要求，色谱柱粗放度好。

本方法采用蒸发光散射检测器检测，样品不需要衍生化，可避免测定过程引入新的杂质，提高了分析精度，用于硫酸西索米星含量测定，具有操作简便、色谱系统稳定、粗放度较好、专属性强、结果准确等优点。

1 中国药典.二部.2005：748-749

2 陈冠华，潘淑萍，胡江宁.硫酸阿米卡星含量及有关物质的HPLC-ELSD测定.中国医药工业杂志，2005，36(3)：171

3 吴燕，张胜强，郭成明，等.HPLC-ELSD法分析硫酸奈替米星与硫酸西索米星的含量和有关物质.中国药品标准，2004，5(4):35

4 王建, 王知坚, 陈贵斌,等.HPLC-ELSD和HPLC-MSn分析硫酸西索米星及其注射液.中国药学杂志，2007，42(1): 62

5 Wang Mingjuan,Hu Changqin.Analysis of spectinomycin by HPLC with evaporative light-scattering detection.Chromatographia,2006,63(5/6):255

6 Megoulas N C,Koupparis M A.Development and validation of novel HPLC/ELSD method for the direct determination of tobramycin in pharmaceuticals,plasma,and urine.Anal Bioanal Chem,2005,382(2):290