高效液相蒸发光散射色谱法测定盐酸氨基葡萄糖片有关物质的研究*

訾晨瑞，石秀伟，郝宏山

(天津市轩宏医药技术有限公司，天津 300192)

氨基葡萄糖(GS)是一种天然的氨基单糖，是软骨基质和滑液中聚氨基葡萄糖的成分，是治疗骨性关节炎的特异性药物。氨基葡萄糖在体外一般以硫酸、盐酸、N-乙酰化物的形式存在，它们在胃酸中完全解离，在小肠中以氨基葡萄糖的原形吸收，一旦被吸收就与最初的酸根无关[1]。

盐酸氨基葡萄糖由于价格较低廉，近年来得到广泛应用，国家药品标准(WS1-SG-028-2001)和USP也有收载。但现行标准中均未制订有关物质检查项。USP30版收载质量标准中仅采用HPLC方法在195 nm处测定含量。盐酸氨基葡萄糖属于小分子多羟基化合物，该类型化合物一般极性较强，由于其结构中含有氨基，极可能与检测池壁产生相互作用，伴随吸附与解吸附的进程，影响到光路而产生负峰[2]。同时由于在紫外区缺乏特征吸收或者仅有微弱的末端吸收，以200nm以下的极限末端吸收波长为检测手段时，易放大溶剂、盐基(无机离子)和共存物质的干扰响应，实验偏差较大。为此，考虑到盐酸氨基葡萄糖的强极性及弱紫外吸收的特性，采用质量型的蒸发光散射检测技术(HPLC-ELSD)检测盐酸氨基葡萄糖片的有关物质。ELSD最大的优势在于它可以检测无特征紫外吸收的物质，采用HPLC-ELSD检测技术对盐酸氨基葡萄糖片进行有关物质检查，有利于更好地控制产品质量，并建立准确、灵敏、快捷的分析方法。

1 仪器与试药

1.1仪器 Lab Alliance Series III型高效液相色谱仪；检测器：Alltech ELSD 2000ES 蒸发光散射检测器；气源：WYK-2型无音无油空压机；工作站：Anastar色谱工作站。

1.2试药 盐酸氨基葡萄糖片(厂家A：深圳资福药业有限公司生产，批号100601、101001、101002，规格：240 mg/片)；盐酸氨基葡萄糖片(厂家B：四川宝光药业股份有限公司生产，批号100502)。三氟乙酸(TFA)、乙腈均为色谱纯；水为屈臣氏蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件及系统适用性 液相色谱柱：Applied Biosystems BrownleeTMColumns，SPHERI-5 CYANO，(220 mm ×4.6 mm，5 μm)。流动相：乙腈-0.1%TFA(三氟乙酸)水溶液(70∶30)；柱温：30 ℃；流速：0.4 ml/min；Alltech ELSD 2000ES 蒸发光散射检测器参数：漂移管温度85 ℃，Gain=1，Impactor=off；进样量：20 μl。

2.2溶液制备

2.2.1供试品溶液 精密称取盐酸氨基葡萄糖片的细粉适量，加流动相适量，超声使溶解，配制成浓度约为0.3 mg/ml(以盐酸氨基葡萄糖计)的样品溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.2.2自身对照溶液 精密量取上述供试品溶液1.0 ml，置50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作为2%自身对照溶液。

2.2.3空白辅料溶液 精密称取空白辅料适量，配制成约相当于盐酸氨基葡萄糖0.3 mg/ml的空白辅料溶液，摇匀，滤过，取续滤液作为空白辅料溶液。

取供试品溶液和空白辅料溶液各20 μl,依“2.1”项下色谱条件进样，盐酸氨基葡萄糖主峰与辅料峰分离度为5.810，大于1.5，与其他杂质峰分离度也大于1.5，辅料峰与1#杂质峰分离度为2.152，大于1.5，分离度良好。见图1。

2.3破坏试验 分别称取空白辅料、盐酸氨基葡萄糖片粉适量，分别加入流动相适量，超声使溶解，用强光照射(4500 LX)12 h以上；分别加入流动相、强酸(0.1 mol/L盐酸)、强碱(0.1 mol/L氢氧化钠)、双氧水溶液(30%过氧化氢)适量，超声使溶解，沸水浴加热2 h以上，冷却至室温后用流动相稀释至刻度，制成浓度约为0.3 mg/ml(以盐酸氨基葡萄糖计)的样品溶液，滤过，取续滤液作为供试品溶液，分别进行测试，记录色谱图。同时与未经破坏的空白辅料及制剂样品进行比较，用以考察可能存在的降解产物和降解途径。结果表明，光、热破坏实验对空白辅料没有破坏作用，对制剂均使其杂质稍有增大；酸碱环境对空白辅料及制剂均有较强的破坏作用；氧化环境对空白辅料及制剂均有一定的破坏作用。各破坏条件下，降解产物峰均能与盐酸氨基葡萄糖峰良好分离，见图1。

2.4重复性试验 按照“2.2.1”和“2.2.2”项下的方法分别制备6份供试品和自身对照溶液，分别精密量取续滤液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以样品溶液峰面积的lg值与称样量lg值的比值计算相对标准偏差，RSD分别为0.71%和1.00%。结果表明，供试品溶液及自身对照溶液重复性良好。

1．盐酸氨基葡萄糖

2.5稳定性试验 分别以重复性试验中供试品溶液及自身对照溶液的1#样品为稳定性0 h样品，分别在室温自然光下放置1、2和4 h后，精密量取各溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，考察溶液的稳定性。结果：供试品溶液及2%对照溶液室温放置4 h，相对标准偏差分别为1.92%和1.94%，稳定性良好。

2.6线性试验 取盐酸氨基葡萄糖片粉适量(约相当于盐酸氨基葡萄糖25 mg)，精密称定，置于50 ml量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，用滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液线性试验贮备液，备用。精密量取此液1.0、2.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 ml分别置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取各溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。以溶液浓度的对数值和主峰面积的对数值计算线性回归方程，得线性方程：Y=1.235 6X+8.139 0(R2=0.999 4)。精密量取供试品溶液线性实验贮备液1.0 ml，置于50 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液线性实验贮备液，备用。精密量取此液2.0、5.0、6.0、8.0分别置于10 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。精密量取上述各溶液20 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以溶液浓度的对数值和主峰面积的对数值计算线性回归方程，得线性方程：Y=0.670 1X+ 6.983 2(R2=0.990 4)。线性试验结果表明，供试品溶液浓度在0.050 1～0.400 8 mg/ml范围内，线性关系良好。自身对照溶液浓度在0.002 004～0.010 02 mg/ml范围内，线性关系良好。同时，当溶液浓度为0.002 004 mg/ml时，主峰的峰高约为基线噪声的3倍，即为供试品溶液杂质的最低检出限，最低检出量约为40 ng。

2.7有关物质的测定 按照“2.2”项下的方法制备供试品及自身对照溶液，在“2.1”项色谱条件下，精密量取供试品溶液与对照溶液各20 μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图至主成分峰保留时间的2.5倍。供试品溶液色谱图中，如有杂质峰，各杂质峰峰面积之和不得大于对照溶液主峰面积。样品有关物质测定结果表明，不同厂家各批号样品有关物质均小于2.0%。结果见表1和图2。

1.盐酸氨基葡萄糖

表1 样品测定结果

3 讨论

3.1色谱柱选择 考虑到盐酸氨基葡萄糖属于小分子多羟基化合物，易溶于水，极性较大，在普通C18色谱柱上难以保留，而正相HPLC系统则会由于采用低极性溶剂作为流动相而存在溶解性方面的问题。因此，选用氰基柱，由于氰基柱和C18柱同样可用于非极性、弱极性和中等极性化合物分析，在反相模式下，其保留性弱于C18，但对强极性化合物的保留性强于C18柱(C18柱基本不保留强极性化合物)。

3.2流动相选择 分别考察了相同样品浓度在不同比例(50%、70%、90%乙腈水溶液)流动相条件下的分离效果。结果显示，当流动相中水的比例较大时，分析时间较短，但不利于流动相在漂移管内汽化，使基线噪声增大，从而导致分析灵敏度减低。另外，水的比例增大，为了使流动相在漂移管内汽化良好，则必须提高漂移管温度，这样有可能造成分析样品部分挥发，导致颗粒量下降而使检测器响应下降。乙腈在流动相比例中增大可有效改善色谱峰形，有利于各组分的基线分离，但乙腈比例增加不利于盐酸氨基葡萄糖的溶解，分析时间也显著延长。综合考虑不同流动相比例下的分离效果、分析时间等因素，选择乙腈-水(70∶30)系统作为流动相。并在此基础上调整其他实验条件，以得到最优化的色谱系统。

3.3仪器条件 本法采用了较高比例的乙腈水溶液(70∶30)作为流动相，溶剂较易挥发，故漂移管温度参考Alltech ELSD 2000ES 蒸发光散射检测器所使用软件ELSD 2000 Control(Version1.5.302.0)的推荐检测条件：漂移管温度83.5 ℃，气体流速2.2 L/min，Gain=1，Impactor=off。并做如下调整：为了使流动相得到更加充分的汽化，将漂移管温度适当调高至85 ℃。同时，由于过快的气体流速也会使微粒量下降而导致信号响应降低，因此适当降低气体流速至2.0 L/min，Gain值及Impactor状态保持不变。

3.4其他 在上述色谱条件的基础上，以达到较好的分离度及相对较高的灵敏度为原则，同时兼顾分析时间等因素进一步调整检测条件。根据试验结果，乙腈与0.1%TFA水溶液组成的流动相系统使出峰顺序发生了改变，同时使盐酸氨基葡萄糖峰响应值显著增大，并有较好的分离度及柱效。另外，较快的流动相流速使得空白辅料峰与杂质峰发生重叠，造成对杂质检出的干扰。此外，柱温的升高在分离效果上没有本质的差别，因此选择比较常规的30 ℃作为柱温。综上所述，最终确定“2.1”项的色谱条件。

现行的国内外质量标准中，有关物质的检查方法并没有收录在内，但有关物质检查项已经日益成为口服制剂的重要检查项目，而HPLC-ELSD有关物质检查方法的使用，相较于传统薄层色谱法有更高的灵敏度及准确性，可以提高产品的质控水平，增加药品使用安全性。根据方法学各项研究试验结果及不同厂家生产的盐酸氨基葡萄糖片有关物质测定结果，本文中建立的HPLC-ELSD法检测盐酸氨基葡萄糖片中有关物质的限度为2.0%。

1 罗娟,胡永善,吴毅,等.盐酸氨基葡萄糖改善膝骨性关节炎症状的效果评估.中国临床康复,2005,9(38):70

2 李海生,白海娇.高效液相色谱应用中的若干问题与解决方法.天津药学,2006,18(2):5