膀胱移性细胞癌组织中S100A4及MMP－2的表达及意义的临床研究

崔子春

山东淄博矿业集团中心医院，山东 淄博 255000

1 材料与方法

1.1 临床资料 我院1998年1月－2002年1月手术切除或经尿道膀胱肿瘤电切标本65例 (原发癌)，经病理学检查诊断为膀胱移性细胞癌。男50例，女15例。年龄为34－75岁，平均年龄51岁。所有TCCB标本根据TNM分为2组:浅表性肿瘤组 (Tis，T1期)20例，浸润肿瘤组 (T2－T4期)45例;根据 WHO病理分级分2组:低级组(G1)17例，高级组 (G2+G3)48例。正常膀胱粘膜15例，男10例，女5例。

1.2 方法 采用免疫组化SP法检测S100A4及MMP－2表达。石蜡标本4um厚连续切片4张 ，其中2张分别行S100A4及MMP－2免疫组化检测，1张作HE染色复查诊断，一张不加一抗作阴性对照，已知阳性的大肠癌组织切片为阳性对照。15例正常膀胱粘膜切片作正常对照。S100A4及MMP－2均为细胞质内表达，镜下观察肿瘤细胞胞质出现黄色、棕黄色、棕褐色颗粒状，染色明显高于背景为阳性。在双盲的情况下由两位病理科主任医师对每张切片进行全面观察，每例切片随机选10个高倍视野 (400倍)。以阳性细胞百分率及染色强度为判定标准。阴性 (－):染色细胞数＜10%;弱阳性 (±):阳性细胞数10%～40% ，染色浅淡;阳性 (+):阳性细胞数在40%～80% ，染色强度中等;强阳性 (++):阳性数＞80% ，染色较深。

1.2.1 切除的标本经10%福尔马林固定，常规脱水，石蜡包埋，4μm厚连续切片，分别进行 HE染色，免疫组化染色。

1.2.2 免疫组化 采用PV－9000试剂盒两步法。

试剂:一抗为兔抗人基质金属蛋白酶MMP－9，多克隆 (1:50);兔抗人基质金属蛋白酶 MMP－2，多克隆(1:100);兔抗人S100A4蛋白，多克隆 (1:200);鼠抗人P53蛋白，单克隆 (1:100);试剂盒以及DAB均购自北京中杉金桥有限公司。

染色步骤:(1)石蜡切片脱蜡水化后，用PBS(PH7.4)冲洗3次，每次3分钟。

(2)抗原修复，用不休钢压力锅，加人0.01M柠檬酸型缓冲液，PH值=6.6，放到电炉加热，压力阀喷气时，持续加热2分钟，压力锅离开热源后自然冷却到室温。取出切片PBS冲洗3×3。

(3)染色评分，S100A4蛋白为细胞质和细胞核着色。高倍镜下计数1000个细胞≥20%为阳性 (+)，20－50%(++)，50% (+++)。P53染色核着色，＜10%(+)，10－25%(++)，26—50(+++)， ＞50%(++++)。MMP－2及MMP－9染色细胞质细胞膜为棕黄色颗粒，阳性数 ＜10%(－)，＞10－25(+)，26－50%(++)，50%为 (+++)。

1.3 统计学处理 应用统计软件SPSS 10.0行检验、spearson等级相关分析，P＜0.05被认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 S100A4，MMP－2在膀胱移性细胞癌组织中的表达情况

正常膀胱上皮S100A4和MMP－2均为未见表达或微量表达。S100A4在肿瘤上皮阳性表达细胞和表达强度分布不均匀，在间质组织、血管临近面以及肿瘤侵袭入膀胱深层组织前缘阳性表达细胞多，表达强度也较强。(图1)。膀胱移性细胞癌组织中，浸润肿瘤组S100A4表达显著高于表浅肿瘤组 (P＜0.01)。高级组与低级组比较有显著性差异。(P＜0.01)。MMP－2亦为胞浆表达，TCCB中的阳性表达率为48%，浸润组MMP－2表达显著高于表浅肿瘤组 (P＜0.01).高级组显著高于低级组。(P＜0.01).

表1 S100A4及MMP－2在TCCB表浅肿瘤组和浸润肿瘤组的表达比较

表2 S100A4及MMP－2在TCCB低级组和高级组的表达比较

2.2 S100A4与MMP－2关系在65例膀胱癌标本中，二者共阳性 例，共阴性 例。S100A4和MMP－2表达经spearman相关性检验，有相关关系 (r=0.66，P＜0.01)

表3 S100A4及MMP－2在膀胱移性细胞癌组织的表达关系

3 讨论

本研究通过检测正常膀胱组织和TCCB组织中S100A4的表达情况，显示S100A4蛋白在正常膀胱粘膜微量或未见表达，在膀胱癌组织中的阳性表达率为58%，而在TCCB中则有不同程度的过表达 (P＜0.05)，随着TCCB临床分期、病理分级的升高S100A4蛋白的水平呈现增高趋势 (P＜0.05)。提示S100A4在膀胱癌的侵袭和转移过程中可能起着重要作用。基质金属蛋白酶 (matrix metalloproteinase，MMPs)是近年来倍受关注的一类与肿瘤侵袭性有关的蛋白，其通过对细胞外基质 (ECM)的降解而促进癌细胞对周围组织的浸润，是降解ECM诸成分的关键酶［2～4］，对肿瘤的浸润转移具有促进作用。

4 结论

S100A4和MMP－2的表达水平与膀胱癌的发生、发展、侵袭和转移有密切的关系，可以作为评估膀胱移性细胞癌恶性程度及预后重要指标，同时随着S100A4作用进一步阐明，为膀胱癌的防治提供新的思路和空间。

［1］吴阶平.泌尿外科［M］.济南:科学技术出版社，1993:438－475.

［2］Donato R.S100:a multigenic family of calcium －modulated proteins of the EF－hand type with intracellular and extracellular functional roles［J］.Int J Biochem Cell Biol，2001，33(7):637 －668.

［3］Mazzuccheli L.Protein S100A4:too long overlooked by pathologists［J］.Am J Pathol，2002，160:7 －13.

［4］Bhuvarahamurthy V，Kristiansen GO ，Johannsen M ，et al.Insitu gene expression and localization of metalloproteinases MMP1，MMP2，MMP3，MMP9，and their inhibitors TIMP1 and TIMP2 in human renal cell carcinoma［R］.Oncol Rep，2006，15(5):1379－21384.