加味凉膈散对脂多糖诱发小鼠血小板减少症的影响

王 兵，王勇强，邵 蕾，曹书华

(天津市第一中心医院，天津300192)

近年研究表明，细菌脂多糖(LPS)通过Toll样受体4(TLR4)触发宿主自身免疫，激活血小板使其大量破坏，是脓毒症相关血小板减少的主要原因［1，2］。2008 年10月 ～2009年1月，为探讨加味凉膈散对LPS诱发小鼠血小板减少症的影响及其机制，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1．1 材料 健康雄性清洁级小鼠，8～10周龄，体质量(25±2)g，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。大肠杆菌LPS(Sigma)，ELISA试剂盒(ADL)，酶标仪(奥地利)，血细胞分析仪(日本)。加味凉膈散颗粒由江阴天江药业公司提供，由连翘、栀子、黄芩、淡竹叶、芒硝、玄参、丹参、麦冬、西洋参、大黄、薄荷、甘草组成。

1．2 方法

1．2．1 模型制备 将176只小鼠随机分为8组，对照组8只用生理盐水(NS)0．2 ml/(10 g·d)灌胃3 d后，经尾静脉注射NS 100 μl/10 g，继用NS灌胃3 d。模型组24只用NS灌胃3 d后，参照文献［3］方法经尾静脉注射LPS 8 mg/kg，制备内毒素血症模型，继用NS灌胃3 d。低剂量、中剂量、高剂量防治组各24 只，分别以加味凉膈散 0．94、1．89、2．84 g/ml灌胃3 d，然后经尾静脉注射LPS 8 mg/kg，再用相应剂量加味凉膈散灌胃3 d。低剂量、中剂量、高剂量治疗组各24只，分别于尾静脉注射LPS 8 mg/kg，然后用相应剂量加味凉膈散灌胃3 d。除对照组外，其余各组于尾静脉注射LPS后分别分为6、48、72 h三组。

1．2．2 标本采集及观察指标检测 摘除各组眼球取血1 ml，采用血细胞分析仪检测其血小板计数(PCL);ELISA法检测血浆巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和可溶性CD40配体(sCD40L);流式细胞仪检测血小板TLR4表达。

1．2．3 统计学方法 采用SPSS11．5统计软件，计量资料用±s表示，组间比较用单因素方差分析。P≤0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 各组不同时间的PCL变化 见表1。

2．2 各组不同时间的血浆sCD40L变化 见表2。

2．3 各组不同时间的血浆M-CSF变化 见表3。

2．4 各组不同时间的血小板TLR4表达变化 见表4。

3 讨论

感染诱发的血小板减少症是脓毒症患者死亡的独立风险因素［3］，Toll样受体作为识别细菌共有成分的“模式”识别受体，主要在识别细菌后诱导免疫细胞内炎症介质过度生成，是引发脓毒症的关键因素［4］。在脓毒症中，血小板是联系凝血和炎性反应的关键物质，其表面有多种黏附分子和受体表达。前期研究表明，血小板可表达功能性TLR4，LPS可通过血小板表面TLR4诱导血小板活化，引起血小板减少［2，5］。Cognasse 等发现，LPS 对血小板免疫调节因子释放的调控效力是血小板TLR4介导的。循环中95%以上的sCD40L来源于血小板，是体内血小板活化的血浆标记物。Francois等［6］研究证实，脓毒症患者不明原因的血小板减少症与吞噬血细胞作用和M-CSF升高有关。

表1 各组不同时间的PCL变化(×109/L，±s)

表1 各组不同时间的PCL变化(×109/L，±s)

注:与对照组比较，*P＜0．05;与模型组比较，#P＜0．05;与低剂量治疗组比较，△P＜0．05;与中剂量治疗组比较，☆P＜0．05;与高剂量治疗组比较，▲P ＜0．05;与低剂量防治组比较，★P ＜0．05

组别 n 6 h 48 h 72 h对照组8 1 013．10 ±136．60模型组 24 298．30 ± 79．80* 654．40 ±106．50* 771．50 ±129．30*低剂量治疗组 24 439．28 ± 88．30*# 722．31 ± 88．22* 911．35 ±111．67#中剂量治疗组 24 397．76 ±101．61*# 757．05 ± 93．67* 952．13 ±104．02#高剂量治疗组 24 357．98± 79．47* 576．66± 86．85＊△☆ 879．16±106．75*低剂量防治组 24 629．59±105．62*#△☆▲ 873．78±112．57*#△☆▲ 964．40± 97．01#中剂量防治组 24 747．32± 96．16*#△☆▲★ 822．98± 99．16*#▲ 942．75±101．04#高剂量防治组 24 691．31±103．65*#☆▲ 731．35± 77．34＊▲★ 989．42±124．17#

表2 各组不同时间的血浆sCD40L变化(ng/ml，±s)

表2 各组不同时间的血浆sCD40L变化(ng/ml，±s)

注:与对照组比较，*P＜0．05;与模型组比较，#P＜0．05;与低剂量治疗组比较，△P＜0．05;与中剂量治疗组比较，☆P＜0．05;与高剂量治疗组比较，▲P ＜0．05;与低剂量防治组比较，★P ＜0．05

?

表3 各组不同时间的血浆M-CSF变化(pg/ml，±s)

表3 各组不同时间的血浆M-CSF变化(pg/ml，±s)

注:与对照组比较，*P＜0．05;与模型组比较，#P＜0．05;与低剂量治疗组比较，△P＜0．05;与中剂量治疗组比较，☆P＜0．05;与高剂量治疗组比较，▲P ＜0．05;与低剂量防治组比较，★P ＜0．05

组别 n 6 h 48 h 72 h对照组8 179．35 ±15．74模型组 24 394．62 ±27．53* 337．78 ±31．02* 289．63 ±23．66*低剂量治疗组 24 340．50 ±34．51*# 293．13 ±29．47*# 288．52 ±21．74*中剂量治疗组 24 320．55 ±26．28*# 296．93 ±26．65*# 262．91 ±23．68*#高剂量治疗组 24 363．21±35．27*#☆ 303．69±24．49*# 280．17±29．71*低剂量防治组 24 298．83±34．50*#△▲ 291．92±24．71*# 252．41±36．10*#△▲中剂量防治组 24 265．22±22．07*#△☆▲★ 279．33±28．92*# 265．33±27．68*高剂量防治组 24 268．97±27．74*#△☆▲★ 245．15±25．18*#△☆▲★ 239．93±23．56*#△▲

表4 各组不同时间的血小板TLR4表达变化(%，±s)

表4 各组不同时间的血小板TLR4表达变化(%，±s)

注:与对照组比较，*P＜0．05;与模型组比较，#P＜0．05;与高剂量治疗组比较，▲P ＜0．05

组别 n 6 h 48 h 72 h对照组8 45．76 ±2．40模型组 24 50．37 ±3．20* 48．98 ±1．77* 46．71 ±2．74低剂量治疗组 24 48．84 ±2．79* 48．37 ±2．59 47．06 ±2．70中剂量治疗组 24 47．81 ±2．68 47．37 ±2．75 46．82 ±2．34高剂量治疗组 24 49．66 ±3．51* 49．95 ±2．87* 46．29 ±2．97低剂量防治组 24 47．91 ±2．53 46．93 ±2．63▲ 45．75 ±2．49中剂量防治组 24 47．74 ±3．03 47．36 ±2．81▲ 46．14 ±2．88高剂量防治组 24 46．85 ±2．42#▲ 46．48 ±2．74▲45．38 ±2．02

本研究显示，小鼠尾静脉注射 LPS后6 h其PCL下降近70%，血小板TLR4表达明显增加，血浆M-CSF、sCD40L明显升高;提示内毒素血症时血小板表达TLR4上调，并随着以M-CSF升高为特征的巨噬细胞过度活化及以sCD40L升高为特征的血小板活化，使血浆M-CSF升高;一方面上调血小板表达TLR4，增强其识别并结合其配体LPS的能力，可增进血小板活化、释放及参与炎症反应的功能;另一方面M-CSF升高伴发的吞噬血细胞作用可使血小板寿命缩短，两种过程都可增加血小板的消耗，使循环中的PCL进一步减少。

内毒素血症动物模型的病机特点是毒邪内蕴、络脉瘀滞、正气频衰，毒、热、瘀在其发病过程中相互搏结。本研究以解毒清热名方凉膈散(载宋《和剂局方》)为基本方加味，方中连翘清热解毒、透散上焦之热;配黄芩以清胸膈郁热，栀子通泻三焦、引火下行，大黄、芒硝泻火通便，荡涤中焦燥热内结;薄荷、竹叶轻清疏散，解热于上。根据“先证而治，截断病势”的治则，加用玄参、丹参以凉血滋阴、化瘀解毒;并在此基础上加用西洋参补肺降火、生津液，以防热盛而伤气阴。全方清上与泻下并行(泻下为清泻胸膈郁热而设)，体现“以泻代清”和给邪以出路，同时兼顾热盛伤正，体现祛邪而不忘扶正，全方以攻逐毒邪为主，兼顾化瘀通络扶正。

本研究显示，与模型组比较，加味凉膈散防治组PCL升高，M-CSF、sCD40L、TLR4 降低;且随剂量增加，其作用增强。表明加味凉膈散可能通过拮抗LPS与血小板TLR4结合，抑制血小板TLR4表达上调，减少血小板及巨噬细胞过度活化，从而缓解LSP诱发的M-CSF减少。

［1］Levi M，Lowenberg EC．Thrombocytopenia in critically ill patients［J］．Seminars in Thrombosis ＆ Hemostasis，2008，34(5):417-424．

［2］Aslam R，Speck ER，Kim M，et al．Platelet Toll-like receptor expression modulates lipopolysaccharide-induced thrombocytopenia and tumor necrosis factor-alpha production in vivo［J］．Blood，2006，107(2):637-641．

［3］Suzuki T，Takahashi T．Tissue-specific gene expression of hemeoxygenase-1(HO-1)and non-specific delta-aminolevulinate synthase(ALAS-N)in a rat model of septic multiple organ dysfunction syndrome［J］．Biochem Pharmacol，2000，60(2):275-283．

［4］Harter L，Mica L，Stocker R，et al．Increased expression of toll-like receptor-2 and-4 on leukocytes from patients with sepsis［J］．Shock，2004，22(5):403-409．

［5］Cognasse F，Hamzeh H，Chavarin P．Evidence of Toll-like receptor molecules on human platelets［J］．Immunol Cell Bio，2005，83(2):196-198．

［6］Francois B，Trimoreau F，Vignon P，et al．Thrombocytopenia in the sepsis syndrome:role of hemopha-gocytosis and macrophage colony stimulating factor［J］．Am J Med，1997，103(2):114-120．