沙眼衣原体临床株基因分型及体外药敏试验结果分析

杨丽娜，江 勇，刘全忠

(1天津医科大学第二医院，天津300211;2天津医科大学总医院)

沙眼衣原体(Ct)是一种严格的细胞内寄生菌，其所导致的泌尿生殖道感染在发达国家和某些地区已成为最常见的性传播疾病;在我国其发病率于2001年位于8种性病之首［1］。近年来，临床上Ct感染治疗失败的报道愈来愈多［2］，有关其耐药的报道亦逐年增多。2005年4月～2007月3月，我们对52株Ct临床株进行基因分型和体外药敏试验，旨在为Ct感染的临床治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 细胞:McCoy细胞系由天津性传播疾病研究所保存。标本:收集2005～2009年天津市性传播疾病研究所门诊就诊的237例患者(男190例，女47例;年龄19～60岁，取材前均停用任何抗菌药物2周以上)的尿道或宫颈拭子标本，直接免疫荧光法镜下均检测到Ct，淋球菌、支原体检查均阴性;菌株经过McCoy细胞培养和碘染色鉴定，置于－80℃冰箱保存;E型标准株购自美国马里兰大学衣原体研究中心。抗菌药物:红霉素(购自美国Sigma公司)，阿奇霉素、克拉霉素、四环素、多西环素、米诺环素、左氧氟沙星、司帕沙星、莫西沙星(购自中国药品生物制品检定所)，所有药物按理化性质溶解，分装，－70℃保存。用无抗感染液(含放线菌酮，20%胎牛血清)稀释成工作浓度，浓度依次为 4、1、0.128、0.625、0.5、0.128、1、0.128、0.24 μg/ml。

1.2 方法

12.1 Ct培养 应用McCoy细胞培养法对标本行二代盲传培养，碘染镜下观察结果。对阳性标本(碘染后镜下观察到衣原体包涵体)继续传代培养至感染率达90%以上，收集标本分装置于－80℃冰箱保存备用。结果237份标本共获得82株培养阳性Ct，阳性率为34.60%。经过4～6次传代培养，其中52株感染率(即每100 μl菌液含有103个包涵体形成单位)超过90%，可进行体外药敏试验。其他菌株或在传代中死亡或浓度持续较低。

1.2.2 基因分型 采用文献omp1限制性内切酶片段长度多态性(RFLP)方法［3］对52株Ct临床株进行基因分型。

1.2.3 药物敏感试验 将9种抗生素分别作用于Ct，测定最低抑菌浓度(MIC);9种药物均设立阴性对照(加药物，但不接种Ct)和阳性对照(接种Ct，但不加药)，设6个等比稀释浓度。先于96孔板中制备致密Ct单层细胞［(每孔(1～2)×105个细胞］。根据确定的接种量接种 Ct，32℃、3 000 r/min离心1 h，置于37℃、5%CO2温箱孵育2 h;弃液，加入无抗感染液及配制好的抗菌药液，依次倍比稀释，使抗菌药形成不同浓度;同前条件孵育44～48 h，孔板风干固定，经碘染色镜下观察结果。镜下未见Ct包涵体的最小稀释浓度即为测试药的MIC。

1.2.4 统计学方法 应用SPSS17.0统计软件包，各种抗菌药物的MIC值比较应用方差分析。检验水准 α =0.05。

2 结果

2.1 基因分型 52株Ct共测出3种基因型，其中J型1株、G型2株、E型49株。

2.2 药物敏感试验 共发现13株红霉素耐药株(MIC1～2 μg/ml，MIC值超过血药浓度和组织药物浓度)，未发现对其他抗菌药耐药的菌株。9种抗菌药物对Ct的MIC见表1。方差分析显示，红霉素的MIC值明显高于其他抗菌药物，克拉霉素的MIC值明显低于其他抗菌药物，P均＜0.05。即Ct对克拉霉素最为敏感。

表1 9 种抗菌药物对52 株 Ct的 MIC(μg/ml，±s)

表1 9 种抗菌药物对52 株 Ct的 MIC(μg/ml，±s)

MIC红霉素 1.11 ±0.57(0.250 ～2.000)抗菌药物阿奇霉素 0.41 ±0.15(0.063 ～1.000)克拉霉素 0.02 ±0.01(0.004 ～0.064)四环素 0.32 ±0.14(0.079 ～0.625)多西环素 0.06 ±0.02(0.016 ～0.125)米诺环素 0.03 ±0.02(0.004 ～0.064)左氧氟沙星 0.81 ±0.27(0.125 ～1.000)莫西沙星 0.09 ±0.05(0.030 ～0.240)司帕沙星 0.09 ±0.04(0.032 ～0.128)

3 讨论

衣原体是一类能通过细胞滤器、有独特发育周期、严格细胞内寄生的原核细胞型微生物。其特点:具有DNA和RNA两种类型的核酸;二分裂方式繁殖，发育周期特别;细胞壁成份中含有肽聚糖;含有核蛋白体;对多种抗生素敏感。衣原体广泛寄生于人类、哺乳动物及鸟类，仅少数有致病性。只有沙眼衣原体和鹦鹉热衣原体可引起人类疾病。目前已知衣原体有15种血清型，A、B、Ba、C血清型主要引起眼部疾患，D-K型引起生殖器疾患，L-1-L3型引起性病淋巴性肉芽肿。Ct直径300～400 μm，在细胞内生长繁殖，有特殊的发育周期，感染力为基本小体，增殖力为网状体，在电镜下可见胞膜呈有丝分裂繁殖。以往研究显示Ct对利福平、四环素、红霉素均敏感。

本研究共检测出E型Ct株49株，显示天津地区沙眼衣原体分布以E型为主。大环内酯类药物对Ct按MIC值由高到低的顺序排列依次是红霉素、阿奇霉素、克拉霉素，其中红霉素的MIC值与韩建德等［4］报道的相近，但低于以往报道［5］;共发现 13株耐红霉素株，耐药株所占比例较高(25%)，表明天津地区已出现红霉素耐药菌株，红霉素已不宜作为泌尿生殖道 Ct感染的一线药物。研究发现，Ct在体外呈“异形耐药”［6］，即包括敏感群体和耐药群体。本研究在MIC值显示耐药的情况下，发现少量包涵体，有时仅为一、两个包涵体，说明只有这一小部分对红霉素耐药;临床上部分对红霉素耐药患者应用红霉素后虽未能治愈但可获得临床症状缓解，亦进一步证实“异形耐药”。阿奇霉素是新的大环内酯类药物，对Ct具有较低抑菌、杀菌浓度(有效血药浓度为0.4 ～0.45 μg/ml)。美国 CDC 推荐阿奇霉素1 g单次口服治疗Ct感染有效，但3个月内15%～20%的患者持续感染或复发，4个月临床治愈率为65% ～75%［7，8］。我们既往研究显示，阿奇霉素治疗1个月Ct阴转率只有44.44%［9］，明显低于国外报道。本研究阿奇霉素的MIC值低于韩建德等［4］报道，且其中 40 株(75.47%)MIC 值超过血药浓度;虽未发现阿奇霉素耐药株，但阿奇霉素耐药趋势明显。提示阿奇霉素不宜作为治疗泌尿生殖道Ct感染的首选药物。本研究克拉霉素MIC与文献报道［4］相近，且抑菌浓度低 ;其中1例红霉素耐药者应用其他抗菌药物后Ct仍阳性者改用克拉霉素治疗后Ct转阴，说明克拉霉素适用于对红霉素耐药和顽固性病例的治疗。

本研究未发现四环素类和喹诺酮类药物的耐药菌株。四环素类药物MIC值由高到低依次是四环素、多西环素、米诺环素;四环素的MIC值低于既往报道［10］，可能与四环素近年来临床应用减少有关;多西环素的MIC值与以往报道相当［5］;米诺环素是一种高效、速效、长效的半合成四环素，其抗菌作用在四环素类中较强，本研究未发现耐药菌株，但42份(80.77%)标本的 MIC值高于韩建德等［4］的报道。喹诺酮类药物:33株Ct对左氧氟沙星及司帕沙星的MIC值均高于韩建德等［4］的报道，提示Ct对喹诺酮类药物的敏感性降低。本研究未发现莫西沙星的耐药株，但23株(43.40%)Ct的MIC值高于以往报道［4］。本研究发现Ct对米诺环素和莫西沙星敏感度降低，推测与近年来治疗泌尿生殖道Ct感染中二者广泛应用有关。本研究体外药敏试验分离到的耐药株明显低于临床治疗失败的病例数，此与药物在人体内作用部位的浓度、药物与受体的作用力、给药途径及衣原体异型耐药、持续感染状态等诸多因素有关，有必要进行深入研究。

［1］龚向东，叶顺章，张君炎，等.1991～2001年我国性病流行病学分析［J］.中华皮肤科杂志，2002，35(3):178-182.

［2］Magbanua JP，Goh BT，Michel CE，et al.Chlamydia traehomatis variant not detected by plasmid based nucleic acid amplification tests:molecular charaeterisation and failure of single dose azithromycin［J］.Sex Transm Infect，2007，83(4):339-343.

［3］刘全忠，王千秋，齐蔓莉，等.衣原体与衣原体疾病［M］.天津:天津科学技术出版社，2004:30-34.

［4］韩建德，陈开木，廖绮曼，等.生殖道沙眼衣原体对几种抗菌药物敏感性的研究［J］.中华皮肤科杂志，2006，10(39):559-561.

［5］尚淑贤，夏隆庆，邵长庚，等.不同抗菌药物体外对沙眼衣原体的单独和联合抗菌作用观察［J］.中华皮肤科杂志，2005，38(5):282-284.

［6］Omani J，Bhullar VB，Workowski KA，et al.Multiple drug resistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure［J］.Infect Dis，2000，181(4):1421-1427.

［7］Stamm WE.Chlamydia trachomatis:The persistent pathogen［J］.Sex Transm Dis，2001，28(12):684-689.

［8］Stamm WE，Hicks CB，Martin DH，et al.Azithromycin for empirical treatment of the nongonococcal urettritis syndrome in men.A randomized double blind study［J］.JAMA，1995，274(7):545-549.

［9］陈伟，刘全忠.沙眼衣原体泌尿生殖道感染迁移性临床研究［J］.中国麻风皮肤病杂志，2009，25(2):105-107.

［10］侯淑萍，江勇，邵丽丽，等.天津地区沙眼衣原体野生株耐药鉴定及机制探索［J］.临床皮肤科杂志，2009，38(8):487-490.