实验性脑出血后大鼠行为学和血肿周围组织病理学的研究

陈 娟 胡晓晴 刘永明 曾文高 倪厚杰 唐洲平

脑出血(intracerebral hem orrhage,ICH)发病率高,占急性脑血管病的20%～30%,急性期病死率可达30%～40%,是急性脑血管病中最高的[1]。本实验采用VII型胶原酶法制备大鼠脑出血模型,观察模型大鼠神经行为学和脑组织病理学的改变,进一步了解此模型特点为脑出血的研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料和设备

实验动物：健康SD大鼠40只,体重220～280 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供[许可证号：SYXK(鄂)2004-2007]。主要设备：大鼠脑立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司),微量进样器(上海佳安分析仪器厂),牙科钻(郑州市一美牙科工业有限公司),恒温冰冻切片机(沈阳市龙首电子仪器有限公司),显微镜(日本OLYPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 根据Rosenberg等[2]报道的胶原酶诱导ICH模型法建立大鼠尾状核ICH模型。实验过程中对大鼠处置符合动物伦理学标准;6%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(1m l/200 g),俯卧位将大鼠固定在江湾大鼠脑立体定位仪上,先将门齿挂在门齿钩上,固定双耳间线,再将门齿固定在门齿钩上,使门齿钩平面较耳间线平面低2.4 mm,使前囟和后囟位于同一平面上;头颅顶部常规消毒后在双耳间线与双眼间线之间取正中矢状切口1.5 cm,切开至皮下;3%双氧水腐蚀颅骨外膜,暴露前囟及冠状缝;根据包新民图谱[6]定位右侧尾状核(前囟右旁开3.2 mm,硬脑膜下5.6mm,向后1.4mm),在此处用牙科钻钻一直径约1.0mm的圆孔,深达硬脑膜表面;用微量注射器抽取Ⅶ型胶原酶液1.5μl(内含0.5 UⅦ型胶原酶),将微量注射器固定于定位仪上,沿钻孔垂直进针至硬脑膜下5.6mm处,将Ⅶ型胶原酶液缓慢推注入脑内,约5min,停针2 min,缓慢退出颅外;用骨蜡封闭颅骨钻孔,防液体沿针道外溢,最后缝合皮下组织及皮肤。假手术组除不注射VII型胶原酶外,其余条件完全一致。假手术组和脑出血组大鼠清醒后按照Zea Longa(0～4分)法对大鼠神经功能进行评分[3],即0分：无神经系统损伤症状,活动正常;1分：提尾时不能完全伸展对侧前肢;2分：行走时身体向手术对侧转圈;3分：向手术对侧倾倒;4分：不能自发行走,意识丧失。1～3分视为模型制作成功。各组大鼠在1、3、7、14、28 d五个时间点进行1次行为学评分。

1.2.2 组织形态学观察 各组大鼠经水合氯醛麻醉后 ,ICH 后 1、3、7、14、28 d各时间点将大鼠断头取脑,oct胶包裹,于-80℃的异戊烷中速冻3～5 min,取出于-80℃冰箱保存备用;连续冰冻脑组织切片(10 um),以针孔为中心行冠状位切片;切片行常规HE染色,冰冻切片用多聚甲醛固定10～30 s,流水洗1～2 s,苏木精液染色30～60 s,流水洗去苏木精液 5～10 s,1%盐酸乙醇 1～3 s,流水洗1～2 s,促蓝液返蓝 5～10 s,流水冲洗 15～30 s,0.5%伊红染色 30～60 s,蒸馏水稍洗 1～2 s,80%乙醇1～2 s,95%乙醇 1～2 s,无水乙醇 1～2 s,石炭酸二甲苯 2～3 s,二甲苯(Ⅰ)2～3 s,二甲苯(Ⅱ)2～3 s,中性树胶封固;在光镜下观察血肿及周围组织学变化。

1.2.3 统计学处理 采用SPSS11.0软件包,组间采用t检验,P＜0.05为有显著差异。

2 结 果

2.1 实验动物数量 本实验脑出血组共有6只大鼠被淘汰(其中4只于出血后48h死亡,考虑与严重脑水肿有关;2只无神经功能缺损症状,证实为血肿破入脑室而致),剔除上述情况后随机补充,最终分析仍为40只大鼠。

2.2 神经行为学改变

假手术组的所有大鼠麻醉清醒后均无明显神经功能缺损症状,神经行为学评分为0分,无明显差异。脑出血组大鼠3d时神经功能缺损症状最重,神经行为学评分最高;1 d时神经行为学评分即非常明显,随着时间延长,7 d时评分开始降低,14 d时神经功能缺损已不明显。脑出血组的神经行为学评分显示3 d与1 d和7 d无明显差异(P＞0.05),而3 d与14、28 d差异显著(P＜0.05),且7 d与14、28 d时间点无显著差异(P＞0.05)(图1)。

图1 脑出血组的神经行为学评分显示3 d时神经功能缺损症状最重,3 d与1和7 d无明显差异(P＞0.05),而3 d与14、28 d差异显著(P＜0.05),7 d与14、28 d时间点无显著差异(P＞0.05)

2.3 脑组织显微结构观察

假手术组：仅在针道周围见少量散在的血细胞,以后可见少量增生的胶质细胞,其余部位无明显病理改变,见图2。脑出血组：脑出血1d时尾状核即形成明显的类圆形或不规则形血肿,血肿中心区有散在的神经细胞,周边区有水肿,可见中性粒细胞浸润;3 d时病灶区血肿仍明显存在,脑组织明显水肿,可见细胞间隙增宽,神经元肿胀、胞核溶解甚至消失,见图3;7 d时血肿血细胞溶解增多,水肿减轻,细胞排列不整齐,核形态不规则,部分核皱缩,血肿及周围神经元减少,胶质细胞增生,毛细血管增多,脑组织液化坏死,正常脑组织逐渐消失,见图4;14 d时类圆形或不规则的血肿形成了囊腔,见图5;28 d时囊腔仍在,周边区见胶质细胞进一步增生,见图6。

图2 假手术组几乎正常(HE染色×400倍)

图3 脑出血模型3 d血肿周围脑组织细胞损害明显,细胞肿胀,脑组织松散,显微镜下囊腔增多(HE染色,×400倍)

图4 脑出血模型7 d星型胶质细胞增多,脑组织液化(HE染色×400倍)

图5 脑出血模型14 d,血肿不规则囊腔形成(HE染色×400倍)

图6 脑出血模型28 d血肿囊腔仍然存在,周围胶质细胞增多(HE染色×400倍)

3 讨 论

动物模型的成功选择是实验的关键,目前国内外比较常用脑出血模型制作方法主要有四种[4]：自体血注入法、胶原酶诱导法、微气囊充胀法、自发性脑出血模型。自体血注入法用于大鼠时的重复性差,尤其是注血量、血肿大小与部位难以掌握,所致血肿形态不一,常伴有血液外渗到胼胝体白质及脑室内。微气囊充胀法未涉及到出血和脑实质之间的重要关系,且无血管活性因子的作用,故其与临床脱节太多,现已较少应用。自发性脑出血模型亦因出血的发生、出血量及部位的不可靠而使其应用受到限制。胶原酶诱导法制作方法简单,快捷且重复性好,与人类脑出血病理、生化和病理生理学有许多相似性[5],且这种模型可产生长期运动缺陷,为研究脑出血后神经功能的恢复和评价药物疗效提供了一个有用的模型[6]。故本实验采取了此种模型。

本实验结果表明,脑出血后1 d时即出现神经功能缺损症状,3 d时神经功能缺损症状最明显,可能与脑出血后脑水肿有关,这与以往的研究结果一致。7 d时行为学评分下降,脑出血后14 d时大鼠神经功能缺损症状逐渐恢复。组间比较,脑出血7 d以后已无显著差异。分析原因可能有大鼠神经功能恢复能力强,而脑出血后神经行为学有自然恢复的过程[7];另外Longa评分法较粗糙,不能精确显示各组评分,且分值差距较小。脑出血的病理生理改变除血肿本身的占位性损害外,尚有周围脑组织血液循环障碍、代谢紊乱如酸中毒、血管运动麻痹、血脑屏障受损及血液分解产物释放多种生物活性物质对脑组织的损害。本实验观察到随血细胞的渗出,脑水肿加剧,血肿部位出现明显的小裂隙,随着时间延长,血细胞吸收,这些裂隙扩大并汇合成囊腔,囊腔周围有胶质细胞增生,随后囊腔一直存在。

本实验重现了脑出血后血肿的形成、血细胞的吸收、胶质细胞增生、囊腔形成等动态演变过程,这些变化过程结合大鼠脑出血模型为脑出血基础研究及药物干预治疗时间窗提供了依据。

1 吴 江.神经病学.北京：人民卫生出版社,2005.170.

2 Rosenberg GA,Mun-Bryce S,W esley M.et al.Collagenase--induced intracerebral hem orrhage in rats.Stroke,l990,2l(5)：80l-807.

3 Zea Longa E1,Weinstein PR,Carlson S,et a1.Reversiblem iddle cereb ral artery occ lusion w ithou t cranectomy in rat.Stroke,1989,20(10)：84-91.

4 张化彪,张苏明.脑出血模型.国外医学脑血管疾病分册,2002,11(10)：469-471.

5 许 东,文玉军,张莲香,等.胶原酶注入小鼠尾状核建立脑出血模型.中国实验动物学报,2006,14(1)：36-39.

6 李红玲,李玉敏,杨 静.自体血注入法和胶原酶注入法诱导脑出血动物模型的比较.中国临床康复,2006,10(8)：148-150.

7 Ji XH,Li nJ,Wang J.Efect of early rehabilitation intervention on nerve fun ctionrehabilitation of cereb ral hemor rhage patients in recovery stage.Zhong Guo Lin Chuang Kang Fu(Chin JC lin Rehabil),2002,6(11)：1701.