吡格列酮拮抗链脲佐菌素诱导培养皮层神经元损伤的保护作用1)

马国英,杨小荣,赵 欣,赵晋枫,秦华平,史瑞红,张 策

研究发现糖代谢障碍不仅存在于糖尿病而且也存在于阿尔茨海默病(AD)[1],进一步的研究证实糖尿病和AD有共同的病理改变,如糖尿病患者AD的发生率明显高于同龄的非糖尿病者,制作糖尿病的工具药链脲佐菌素(STZ)腹腔注射和脑室注射均可引起神经损伤及AD样的病理变化,脑内也发现有Aβ的沉积和Tau蛋白的过度磷酸化等AD样的病理特征。而AD大多数伴有糖代谢的紊乱。脑室注射STZ可以导致正常大鼠出现AD样的病理变化,如线粒体功能异常、神经元死亡、学习记忆与认知障碍等。在离体神经细胞培养中可以引起细胞活力下降,活细胞数目减少,乳酸脱氢酶(LDH)释放增加。其机制可能是削弱或破坏胰岛素信号转导,破坏胰岛素受体自身磷酸化和内在酪氨酸激酶活性,增加磷酸化酪氨酸磷酸酶的活性[2],导致胰岛素信号转导障碍,引起脑葡萄糖代谢紊乱和能量生成受阻。

吡格列酮(Pioglitazone)属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂,主要通过结合和活化过氧化物酶体增殖物激活的受体γ(PPARs)而增强细胞对胰岛素作用的敏感性,在临床上主要用于2型糖尿病的治疗。已证实吡格列酮对侧脑室注射STZ的大鼠的空间记忆力和海马的突触结构和神经元的受损有保护作用[3]。而同样属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂的罗格列酮对散发性老年痴呆大鼠学习记忆功能有明显的改善作用[4]。噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂可能对AD有预防治疗作用[5]。吡格列酮对由STZ引起的神经损伤有保护作用。前期实验证实STZ对离体培养的神经细胞也具有损伤作用,那么吡格列酮对离体培养的神经细胞STZ损伤是否也有保护作用?

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂 新生1 d～3 d Wistar大鼠(山西医科大学动物管理中心)。STZ、Calcein-AM 购于 Sigma公司,吡格列酮由浙江华义医药有限公司惠赠,DMEM购于Gibico,胎牛血清(FBS)购于杭州四季青公司。将STZ溶于D-Hanks溶液中,配成10 mmol/L的母液,由于STZ溶液的半衰期在生理pH值条件下为19 min[6],需要溶解后立即使用。吡格列酮用二甲亚砜(DMSO)溶解,再用DMSO溶液稀释配置成0.1 mmol/L,1 mmol/L,10 mmol/L的母液,常温保存,培养液中DMSO终浓度不得高于0.1%。

1.2 实验分组 神经细胞培养到第7天时,将培养的神经细胞随即分组:由于中枢的胰岛素主要来自两方面,由胰岛产生即外周血浆中的胰岛素透过血脑屏障进入中枢和神经组织自身合成的胰岛素[6],为了更好模拟在体情况,在实验中都加入胰岛素15μU/mL。对照组以全配液培养;STZ组,在全配液培养;吡格列酮组,在全配液中加入终浓度(0.01 μ mol/L,0.1 μ mol/L,1 μ mol/L)的吡格列酮,24 h后除了对照组以外其他组都加STZ(100μ mol/L)。共同作用36 h后观察细胞的活力以及活细胞数目(LDH,CCK-8和Calcein-AM染色)。

1.3 原代皮层神经细胞培养 取新生1 d～3 d的Wistar大鼠,将大脑皮层神经细胞分离成单细胞悬液,按细胞浓度为1×106接种于预先用多聚赖氨酸包被的培养皿或96孔板中,放在37℃,5%CO2培养箱中培养。24h后加入阿糖胞苷(10μ mol/L)抑制胶质细胞生长。

1.4 细胞活力分析 在96孔板中培养的皮层神经细胞经提前24 h加入吡格列酮,再经STZ诱导36 h后,还新的全配液,每空加入10 μL的 CCK-8,37℃避光培养 2 h,到酶标仪上测定450 nm吸光度值。

1.5 LDH释放的检测 将皮层神经细胞培养在培养皿中,经提前24 h加入吡格列酮,再加入STZ诱导36 h后,收集细胞培养液进行LDH活性的检测。

1.6 Calcein-AM染色 将皮层神经细胞培养在有玻片的培养皿中,经提前24 h加入吡格列酮,再加入STZ诱导36 h后,用PBS液冲洗3次,加入终浓度为10μ mol/L的Calcein-AM,37℃避光培养 20 min,再经 PBS避光洗涤 3次后,在激光共聚焦显微镜(Olympus,FV-1000)下观察细胞,激发波长为490 nm,发射波长为515 nm拍片。

1.7 统计学处理 测定结果由统计软件SPSS 13.0进行分析,用均数±标准差(±s)表示,进行单因素方差分析,检验水准取α=0.05,P＜0.05有统计学意义。

2 结 果

2.1 CCK-8的测定 STZ组与对照组比较,细胞活力明显下降,STZ组由对照组的100%降至63.93%(P＜0.01);提前24 h加入吡格列酮(0.01 μ mol/L)细胞活力升高12.83%(P＜0.01,n=4);吡格列酮(0.1 μ mol/L)细胞活力升高 6.06%(P＜0.05);吡格列酮不能抑制STZ引起的细胞活力下降。详见图1。

图1 吡格列酮对STZ诱导皮层神经细胞损伤的保护作用(CCK-8检测)

2.2 Calcein-AM染色 STZ处理后,活细胞的数量明显减少,伴有突起数目明显减少;提前加入吡格列酮明显抑制STZ引起的活细胞数目减少,突起数目明显增加;吡格列酮抑制STZ引起的活细胞数目减少,突起数目增加;吡格列酮不能抑制STZ引起的活细胞数目减少。

2.3 LDH释放的检测 STZ组与对照组比较,LDH的含量明显增加,释放量增加42.31%(P＜0.01);吡格列酮(0.01μ mol/L)可以降低有STZ引起的细胞损伤,使 LDH的释放减少14.46%(P＜0.01);吡格列酮(0.1 μ mol/L)可以降低STZ引起的细胞损伤,使LDH的释放减少10.04%(P＜0.05);吡格列酮(1 μ mol/L)不能抑制STZ引起细胞 LDH的释放。详见图2。

图2 吡格列酮对STZ诱导皮层神经细胞损伤的保护作用(LDH释放水平检测)

3 讨 论

中枢胰岛素主要由胰岛产生即外周血浆中的胰岛素透过血脑屏障进入中枢,然而研究发现神经组织自身也可以合成胰岛素并参与代谢调节而发挥作用[7]。胰岛素受体在脑内皮层、海马等与认知功能密切相关的区域分布较密集。胰岛素通过它与细胞膜上的胰岛素受体(IR)相结合,通过胰岛素信号转导过程激发细胞内特定的生理生化反应[8]。

研究证实,糖代谢紊乱和AD发病机制有密切的联系,尤其在晚发性AD中,糖代谢紊乱可能是重要的始动因子。多种证据显示脑内糖代谢障碍可以引起认知功能受损,而认知功能障碍为主的AD常伴有脑内糖代谢障碍。由于糖代谢紊乱(糖尿病)与AD间有着非常密切的联系,有可能存在同样的发病因素和病理过程,因而有专家提出AD可能是一种大脑特异的神经内分泌疾病或者称“3型糖尿病”[9]。

吡格列酮是一种作用于PPAR-γ的胰岛素增敏剂,PPAR-γ被激活后提高胰岛素敏感性,通过胰岛素受体和受体后途径,加强胰岛素信号系统作用,增加靶细胞中胰岛素受体的表达;增加胰岛素受体底物(IRS)的表达,促其磷酸化;增加靶细胞中PI-3K调节亚基的表达,促进胰岛素功能实现。吡格列酮也可能通过增加胰岛素受体酪氨酸激酶活性,起到保护作用。吡格列酮对侧脑室注射STZ大鼠空间记忆力和海马突触结构和神经元的受损有保护作用[1]。而同样属于噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂的罗格列酮对散发性老年痴呆大鼠学习记忆功能有明显的改善作用[2]。

本实验应用离体神经细胞培养的方法证实一定浓度的吡格列酮(0.01 μ mol/L和 0.1 μ mol/L)可拮抗STZ对培养的神经细胞产生的毒性作用,包括细胞活力的逐渐增加,LDH的释放逐渐增少,以及活细胞数目的逐渐增加。本实验结果为吡格列酮的神经保护作用提供了新的证据,即除已经证实的吡格列酮对侧脑室注射STZ引起的大鼠神经系统损伤有保护作用以外,在离体情况下,吡格列酮同样可以起到保护作用。但本实验所观察到的低浓度吡格列酮(0.01 μ mol/L和0.1 μ mol/L)可以发挥保护作用,而较高浓度吡格列酮(1 μ mol/L)不能抑制发挥保护作用,其详细机制不明,有待进一步研究。

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