脑出血后Eprin-b3的表达与白质损伤的相关性

罗 岗,李东芳,贾晓涛,刘正姣

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)是常见的脑血管疾病,随着我国人口老龄化进程的加快,脑出血患者的发生率、致残率、死亡率明显升高 。在脑出血的患者中,50%以上主要是大脑基底节区的出血,而基底节区主要由白质组成,因此,脑出血后主要损伤的是大脑白质。脑白质主要由神经纤维组成(树突、轴突、胶质细胞),其在神经系统中起着传递信息,分泌和支撑神经元等作用,因此,脑白质损伤(神经纤维的断裂、变性和坏死)对机体会产生十分不利的影响。髓鞘相关抑制因子(mylinassociated inhibitor factors,M AIFs)的发现及对其作用机制的研究成为近年研究的热点。尤其是它的一个新成员——Ephrin-b3的重要作用成为目前关注的焦点,既往在脑梗死方面有研究,但在脑出血未见相关报道。有研究发现[1]Ephrin-b3表达于髓鞘少突胶质细胞,其抑制活性等同于p75介导的Nogo-66,M AG,OMgp的活性,所以以Ephrin-b3为切入点,观察成年大鼠脑出血后其与脑白质损伤的相关性,对于中枢神经系统(CNS)再生具有重要意义。本研究采用自体血注入法应用HE染色法,观察血肿周围组织学的变化,并测定对照组和实验组不同时间点血肿周围Ephrin-b3的表达,探讨他们之间的关系,为脑出血的治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂 选用成年健康雄性Wistar大鼠48只(山西医科大学生理系动物试验中心提供),营养中等,鼠龄(3～4)个月,体重250 g±15 g。Ephrin-b3试剂盒(太原市莱尔生物科技有限公司);普通试剂由山西医科大学实验中心提供。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 本实验随机分为对照组和实验组,对照组分为正常对照组(A组)、假手术组(B组),每组各8只;实验组为6 h,24 h,48 h,72 h,7 d脑出血组,分别记为D组,E组,F组,G组,H组,每时相点各8只大鼠,每时相出血组分别向大鼠大脑内囊部注射自体血100μL。

1.2.2 模型制作 大鼠术前12 h禁食,可自由饮水。参照Xue等[2]方法制备大鼠模型。用微量注射器自尾动脉分2次取自体非肝素不凝血,每次 50 μ L,共计100 μ L[3,4]。以大鼠脑切片中有明显的圆形、椭圆形或不规则血肿存在,血液无针道反流,无蛛网膜下腔出血,无血肿破入脑室者为模型成功标准,术后昏迷或死亡者剔除。符合模型成功标准的48只。

1.2.3 标本制备 脑出血各时相组,对照组分别在出血模型建立成功后的 6 h,24 h,48 h,72 h,7 d后,颈椎脱臼处死,迅速取脑,各组随机取两只大鼠脑组织迅速固定,石蜡包埋后,在内囊部位做冠状位切片,厚约5 μ L,HE染色,观察组织学变化。

1.2.4 脑组织匀浆制备与指标的检测 将脑组织用生理盐水漂洗,去除表面血液,滤纸拭干,精确称重后制备10%匀浆。低温离心机将匀浆以3 500 r/min离心15 min,取上清液检测Ephrin-b3,严格按照试剂盒提供的步骤进行测定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件,计量资料用均数±标准差(±s)表示,采用方差分析,进行两两比较LSD-t检验。

2 结 果

2.1 光镜下HE染色 HE染色病理观察,出血6 h组于血肿周围可见变性坏死区域,细胞排列不整齐,核形态不整,部分核皱缩、髓质均可见片状间质水肿,但未见炎性细胞浸润。出血24 h组除可见变性坏死区域扩大外,细胞周围出现空白区,细胞分布不均匀,神经元细胞数减少,可见散在淋巴细胞浸润。出血72 h组可见组织水肿明显,神经元细胞数明显减少,可见细胞崩解小体,中性粒细胞及淋巴细胞浸润,可见中性粒细胞附壁现象。假手术组和正常对照组未见异常变化。

2.2 各组大鼠不同时间点Ephrin-b3水平 大鼠脑出血后6 h血肿周围Ephrin-b3的表达较正常增多,24 h,48 h表达逐步增高,72 h表达达到高峰,与相应时间点假手术组和正常组比较,有统计学意义(P＜0.01),出血7 d组与假手术组和正常对照组比较无统计学意义。详见表1。

表1 脑出血后不同时间点实验组Ephrin-b3的表达(±s)

表1 脑出血后不同时间点实验组Ephrin-b3的表达(±s)

组别 n Ephrin-b3 A组 6 0.124±0.013 B组 6 0.148±0.006 C组 6 0.306±0.0091)2)D组 6 0.519±0.0171)2)3)E组 6 0.778±0.0251)2)3)4)F组 6 1.469±0.0341)2)3)4)5)G组 6 0.136±0.0373)4)5)6)与A组比较,1)P＜0.01;与B组比较,2)P＜0.01;与C组比较,3)P＜0.01;与D组比较,4)P＜0.01;与E组比较,5)P＜0.01;与F组比较,6)P＜0.01

3 讨 论

脑出血损伤主要是基底节区脑白质的损伤,病理改变表现为局灶性血肿周围白质囊性变、凝固性坏死或弥漫性神经胶质细胞(oligodendrocyte,OL)凋亡、坏死[5,6]。本研究发现,实验组在出血6 h后血肿周围可见变性坏死区域,出血24 h组除可见变性坏死区域扩大外,细胞周围出现空白区,出血72 h组可见组织水肿明显,神经元细胞数明显减少,可见细胞崩解小体,中性粒细胞及淋巴细胞浸润,可见中性粒细胞附壁现象。上述改变最重要的病理生理为血肿本身的变化及血肿周围的继发性损伤,其机制已比较清楚,但针对白质损伤后的治疗措施却甚微,既往脑出血方面主要针对出血后的影响血肿扩大的相关因素进行研究,而对于神经细胞凋亡过程中分泌的神经生长抑制因子未予足够重视,因而人们开始逐渐将重点转向了对血肿周围神经细胞的研究[7]。髓鞘相关抑制因子(mylin-associated inhibitor factors,M AIFs)的发现及对其作用机制的研究成为近年研究的热点。尤其是它的一个新成员Ephrin-b3的重要作用成为目前关注的焦点,既往在脑梗死方面有研究,但在脑出血未见相关报道。Eph是新发现的酪氨酸蛋白激酶(RTK)家族中最大的分支,其分布广泛,结构上高度保守,参与神经系统细胞间相互作用,并与轴突发育路径有关;Ephrin-b3是Eph家族的重要成员之一。成年时期,主要分布在突触和神经纤维的少突胶质细胞中,是一种神经纤维生长抑制因子,在突触重塑和神经的再生过程中有重要的意义[8]。Benson等[9]提出Ephrin-b3是一种髓鞘相关抑制因子,仅表达限于中枢神经系统髓鞘少突胶质细胞;对Nogo,M AG,OMgp,p75基因敲除小鼠的皮质脊髓束再生抑制发挥作用是另一个重要机制。Yiu等[10]发现Ephrin-b3和NgR1/p75一样都可以激活小GTP酶RhoA,引起生长锥的塌陷,表明他们有共同的信号途径,也充分说明了Ephrin-b3在中枢神经系统再生抑制中的重要作用。本实验采用Elisa法定量检测脑出血后血肿周围组织Ephrin-b3的表达水平,结果显示出血周围组织的Ephrin-b3在出血后6 h开始升高,72 h达到高峰,7 d基本上恢复到正常水平,但仍高于正常水平,与HE染色观察到血肿周围组织损伤程度时间一致,提示Ephrin-b3参与了脑出血过程中神经细胞损伤,其表达与脑出血后白质损伤具有相关性。

本研究结果可以得到一个启示,如果能够进一步拮抗Ephrin-b3的作用,则可以从减少生长锥塌陷和减少细胞凋亡两个方面减轻神经细胞损伤及促进再生,为脑出血治疗提供实验依据。

[1]Benson MD,Romero MI,Lush ME,et al.Ephrin-B3 is a myelinbased inhibitor of neurite out growth[J].PNAS,2005,102(30):10694-10699.

[2]Xue M,Del Bigio M R.Intracortical heamorrhage injury in rats:Relationship between blood fraction and brain cell death[J].Stroke,2000,31:1721-1727.

[3]Xi G,Keep RF,Hoff JT,et al.Erythrocytes and delayed brain edema formation following intracerebral hemorrhage in rats[J].J Neurosurg,1998,89:991-996.

[4]周中和,曲方,何祥,等.一种改良大鼠自体血脑出血模型:二次注血/退针法[J].中国临床神经科学,2004,12(4):406-408.

[5]Cai Z,Pang Y,Xiao F,et al.Chronic ischemia preferentially causes white matter injury in the neonatal rat brain[J].Brain Res,2001,898(1):126-135.

[6]Tsuji M,Wilson MA,Lange M S,et al.Minocycline worsens hypoxic ischemic brain injury in a neonatalmouse model[J].Exp Neurol,2004,189(3):58-65.

[7]Del Bigio M R,Yan HJ,Xue M.Intracerebral infusion of a secondgeneration ciliary neurotrophic facto r reduces neuronal loss in rat striatum following ex perimental intracerebral hemorrhage[J].J Neurol Sci,2001,192(1-2):53-59.

[8]Dalva M B,Takasu MA,Lin MZ,et al.EphB receptors interact with NMDA receptors and regulate by in vivo functional imaging[J].J Neurosci,2000,20(15):5841-5847.

[9]Benson MD,Romero MI,Lush ME,et al.Ephrin-B3 is a myelinbased inhibitor of neurite outgrowth[J].PNAS,2005,102(30):10694-10699.

[10]Yiu G,He Z.Signaling mechanisms of the myelin inhibitors of axon regeneration[J].Curr Opin Neurobiol,2003,13(5):545-551.