重组人红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤后XIAP及Smac蛋白表达的影响

郭丽君,袁慧欣,阚卫军,乔振华,薛福平

脑组织局部神经细胞过度凋亡是造成脑缺血再灌注损伤的主要原因之一。近来研究发现,重组人红细胞生成素(rh-EPO)对脑缺血再灌注损伤具有神经保护作用[1],可能与抑制线粒体凋亡途径介导的细胞凋亡有关,而rh-EPO对脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡抑制蛋白(XIAP)、Smac蛋白表达的影响鲜见报道。本研究观察了大鼠脑缺血再灌注损伤后XIAP及Smac蛋白表达的变化情况,探讨 rhEPO对 XIAP及Smac蛋白表达的影响及神经保护作用的可能分子机制,为临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康雄性Wistar大鼠70只,体重220 g～250 g,山西医科大学生理实验室提供。XIAP兔抗大鼠多克隆抗体(博奥森公司);Smac兔抗大鼠多克隆抗体、TUNEL凋亡检测试剂盒、DAB显色剂(均购自北京中杉金桥);rh-EPO(成都地奥);0.23 mm市售渔线;BI-2000医学图像分析系统、PM-10AD光学显微镜(日本OLYMPUS公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备 参照Zea longa线栓法加以改良制备大鼠右侧大脑中动脉阻断(MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型[2]。阻闭1 h后抽出渔线,恢复再灌注。假手术组置入10 mm即可,余步骤同模型组。在缺血期间及再灌注后1h保持体温在(37±0.5)℃。

各组均在术后1 h～2 h大鼠清醒时参照Bederson评分标准[3]进行神经功能缺失体征评分。造模成功的判断标准:以清醒后左侧前肢不能完全伸展,前进时向左侧转圈、倾倒,并出现霍纳征为模型成功的判断标准,不成功者剔除,再随机补充。

1.2.2 分组及标本制备 实验分为3组,假手术组 20只,缺血组及 rh-EPO治疗组,每组25只。于再灌注后即刻,假手术组及缺血组腹腔内注入0.3mL生理盐水;治疗组腹腔内注入rh-EPO(2 500 U/kg),共 5 d。分别于再灌注后 6 h、12 h、24 h、72 h、7d处死大鼠,断头、取脑,去除小脑与脑干,在视交叉前后1 mm范围切取组织,于4%多聚甲醛中4℃固定24 h,常规梯度乙醇脱水,石蜡包埋,连续切取厚约 3 μ m的冠状切片,行TUNEL法检测细胞凋亡、免疫组化检查。

1.3 检测指标

1.3.1 TUNEL法检测细胞凋亡 按照原位TUNEL试剂盒说明书进行凋亡染色,细胞核中出现棕褐色颗粒者为阳性细胞。

1.3.2 Smac、XIAP蛋白免疫组化染色检查采用SP法,具体操作步骤按说明书进行。显微镜下胞浆或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞,每只动物随机取3张切片,每张切片在400倍视野下随机选取不重叠的5个视野计数,取均数。

2 结 果

2.1 神经细胞凋亡情况 缺血组中各时间点凋亡细胞数均显著增加;rh-EPO组阳性反应细胞数均明显减少,着色较浅,与缺血组、假手术组比较有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 Smac蛋白表达 假手术组偶见少量散在Smac蛋白阳性表达,位于胞浆,黄染;缺血组于再灌注6 h有大量Smac阳性细胞出现,位于神经元胞浆及胞核,24 h到达高峰,随后减少,72 h基本降至正常。与缺血组比较,rh-EPO组各时间点Smac阳性细胞均减少(P＜0.05)。详见表1。

表1 各组大鼠皮质Smac蛋白阳性表达(±s)

表1 各组大鼠皮质Smac蛋白阳性表达(±s)

组别 6 h 12 h 24 h 72 h 7 d假手术组 2.67±0.23 3.25±0.94 4.62±1.06 3.78±1.56 2.69±0.51缺血组 31.21±2.31 46.78±3.21 50.67±2.84 37.82±1.93 30.65±3.92 rh-EPO 组 19.76±3.571) 29.62±3.251) 32.61±5.931) 25.76±4.251) 20.68±1.931)与缺血组比较,1)P＜0.05

2.3 XIAP蛋白表达 胞浆或胞核上见黄染者即为阳性细胞。再灌注6 h大鼠XIAP的表达增多,12 h达高峰,之后逐渐下降,72 h XIAP的表达虽然较假手术稍高,但差异无统计学意义。与缺血组比较,rh-EPO组各时间点XIAP阳性细均增加,

72 h仍较6 h明显升高,7 d降至正常。详见表2。

表2 各组大鼠皮质XIAP蛋白阳性表达(±s)

表2 各组大鼠皮质XIAP蛋白阳性表达(±s)

组别 6 h 12 h 24 h 72 h 7 d假手术组 9.21±0.78 14.52±4.06 13.24±3.81 12.89±4.12 10.67±2.14缺血组 14.08±6.21 20.92±5.43 17.31±5.35 15.67±4.95 14.92±6.78 rh-EPO 组 21.65±6.271) 39.87±4.561)2) 34.64±3.721)2) 28.92±3.411)2) 23.62±1.531)与缺血组比较,1)P＜0.05;与 rh-EPO组6 h比较,2)P＜0.05

3 讨 论

脑缺血再灌注后,脑组织可发生坏死和凋亡两种死亡形式,梗死中心以坏死为主,梗死边缘区(即缺血半暗带)以凋亡为主,由于凋亡早期改变是可逆的,因此,挽救缺血半暗带区神经元,减少神经元凋亡的发生,就能明显减轻脑梗死的程度和范围。

rh-EPO作为中枢神经系统中一个新的信号转导分子和神经营养及保护因子,对脑缺血再灌注损伤有保护作用。降低谷氨酸盐毒性;抑制神经细胞凋亡;诱导神经递质的释放,直接或间接影响神经传导;减轻炎症反应;直接的抗氧化作用;保护脑血管内皮,促进脑血管增生等[4,5]。

rh-EPO抑制神经细胞凋亡与Caspase通路密切相关。rh-EPO可通过阻断Caspase-3、Caspase-9等的激活[6],上调bcl-2和bcl-xl基因表达,对抗凋亡的发生[7]。而 rh-EPO对脑缺血再灌注损伤后神经细胞XIAP、Smac蛋白表达的影响鲜见报道。

XIAP是一种内源性凋亡蛋白抑制剂,被认为是迄今作用最强的内源性Caspases抑制因子,其特征性功能结构为氨基端的3个杆状病毒重复序列结构(Baculoviral IAP repeat,BIR)及羧基端具有泛素连接酶E3活性的环指结构域(Ring finger domain,RING)[8]。XIAP抑制Caspase的活性:直接通过BIR结构域与Caspases-3、Caspase-7、Caspase-9结合而抑制其活性;通过RING指结构域的泛素化、溶酶体降解而抑制Caspases降解。本实验观察到,再灌注6 h神经元中XIAP蛋白表达增高,12 h达高峰,以后受到表达上调的Smac抑制、Caspase-3激活后的降解增强及自身进行泛素化而降解,很快下降,至72 h恢复正常。治疗组XIAP阳性细胞数明显增多,且72 h还有较强表达,提示治疗组可能通过促进XIAP表达或抑制其降解,从而抑制Caspase活性、保护神经功能,对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

Smac(第二种天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶激活物)是一种重要的促凋亡蛋白[9],可负性调控XIAP抑制Caspases活性的作用。正常情况下Smac位于线粒体内膜腔,受到凋亡信号刺激线粒体膜孔开放后移位到胞浆,与Apaf-1凋亡复合体、XIAP的BIR3、BIR2结构域竞争性结合解除其对Caspase-9、Caspase-3的抑制,及拮抗XIAP环指结构域泛素连接酶E3活性等多种途径增加细胞对凋亡信号的敏感性,促进细胞凋亡的发生[10]。本实验结果显示,正常脑组织中有少量Smac蛋白表达,脑缺血再灌注后Smac蛋白表达逐渐增高,高峰出现在再灌注24 h,并且少量细胞表现为核染色阳性,说明Smac参与了脑缺血后神经细胞死亡过程。治疗组Smac阳性细胞数减少,提示治疗组可能通过减少Smac表达,对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

rh-EPO对脑缺血再灌注损伤有明显的神经保护作用,提高神经功能,减少脑组织凋亡细胞数,可能与抑制Smac蛋白表达,增加XIAP蛋白表达有关。rh-EPO可影响XIAP/Smac通路,减轻脑缺血再灌注后神经元损伤及细胞凋亡,是rh-EPO脑保护作用的分子机制之一。

[1]Cerami A,BrinesM L,Ghezzi P,et al.Effects of epoetin alfa on the central nervous sy stem[J].Semin Oncol,2001,28(2):66-70.

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[5]丁正斌,全伟,曹志恺,等.不同疗程促红细胞生成素对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经细胞凋亡的影响[J].中华神经医学杂志,2007,6(11):1122-1125.

[6]Chong ZZ,Kang JQ,Maiese K,et al.Apaf-1,Bcl-xL,cytochrome c,and caspase-9 form the critical elements for cerebralvascular protection by erythropoietin[J].Cereb Blood Flow Metab,2003,23(3):320-330.

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[8]Deveraux QL,Leo E,Stennicke HR,et al.Cleavage of human inhibitor of apoptosis protein XIAP Results in fragments with distinct specificities for caspases[J].EMBO J,1999,18(19):52422.

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