加味丹参饮对心肌缺血再灌注损伤血瘀证兔肿瘤坏死因子α和白细胞介素-2的影响1)

李鑫辉,黄政德,葛金文

心肌缺血最有效的治疗措施是恢复血液供应,缺血后恢复血流供应的过程称为再灌注,再灌注可使缺血心肌损伤加重,即产生心肌缺血再灌注损伤(ischermic reperfusion injury,IRI)。心肌IRI的发生、发展是个多因素协同作用的过程。研究证明,炎症在心肌IRI的发生与发展中起着关键作用[1],随着再灌注的进行,大量活化的中性粒细胞聚集在心肌微血管内并浸润到心肌组织中,通过释放细胞炎性物质引起心肌损伤。本实验采用血瘀证兔心肌IRI模型,观察加味丹参饮对心肌IRI时炎症因子及心肌酶的影响,以进一步探讨其对心肌IRI保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 家兔60只,体重1.5 kg～2.5 kg,雌雄兼用。购自湖南中医药大学实验动物中心。许可证号:SYXK(湘)2003-0001。

1.1.2 药物 加味丹参饮(丹参20 g,檀香6 g,赤芍10 g,川芎6 g,当归6 g,红花6 g,生地12 g,黄芪20 g等),药材由湖南中医药大学第一附属医院制剂室提供,浸泡、煎煮、去渣,浓缩至药液浓度为1 g/mL,保存备用。丹参注射液(正大青春宝药业有限公司,生产批号:国药准字Z33020177)每支 10 mL。

1.1.3 仪器与试剂 小动物呼吸机,DW-2000型,上海嘉鹏;放射免疫计数器,ac1500r型,中国科技大学;全自动生化分析仪,CL-7200型,日本岛津;血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2)试剂,购于北京科美东雅生物技术有限公司;乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)试剂,北京九强生物技术有限公司。

1.2.1 动物分组 家兔 60只,随机分为 A组(空白组)、B组(血瘀证组)、C组(IRI组)、D组(预处理组)、E组(丹参组)、F组(加味丹参饮组),每组10只。空白组:于造模同期注射等量生理盐水,同期开胸,冠脉穿线不结扎。血瘀证组:血瘀证造模结束后第2天,开胸穿线不结扎。IRI组:血瘀证造模结束后第2天,开胸结扎冠脉30 min,恢复冠脉血流90 min。预处理组:血瘀证造模结束后第2天,开胸结扎冠脉5 min,再灌注5 min,共反复3次,余同C组。丹参组和加味丹参饮组处理同C组。

1.2.2 造模方法 建立血瘀证动物模型:于兔耳缘静脉缓慢注射去甲肾上腺素 0.1 mg/(kg◦d)连续20 d,于造模 1 d静脉注射牛血清白蛋白 250 mg/kg,间隔10 d,再注射1次,共2次,以血液流变学指标较空白组升高有差异,说明血瘀证动物模型成功。建立心肌缺血再灌注模型:血瘀证家兔用25%乌拉坦(4 mL/kg)麻醉后固定,记录标准Ⅱ导联心电图。气管切开,连接动物呼吸机。开胸暴露心脏,于左心耳下左冠状动脉前降支上1/3处穿线,在线两段各穿1结扎环以阻断冠脉血流。以心电图ST段出现弓背抬高为结扎成功,以ST段下降1/2为血流再灌注成功。

1.2.3 给药剂量与方法 给药剂量根据成人临床剂量,按动物体表面积换算。E组于兔耳缘静脉给药,在开胸前3 d开始静注丹参注射液0.6 mL/(kg◦d);F组灌胃给药,在开胸前3 d开始灌胃加味丹参饮10mL/(kg◦d)[相当于生药含量5.16 g/(kg◦d)];A、B、C、D组在开胸前3 d灌胃等量生理盐水。

1.2.4 实验指标测定 各组在实验结束时颈动脉取血,血清TNF-α和IL-2测定采用放射免疫法,测定LDH和CK-MB,用岛津全自动生化分析仪,由湖南中医药大学第一附属医院检验科测定。

2 结 果

2.1 对心肌缺血再灌注损伤血瘀证兔TNF-α和IL-2水平的影响 C组TNF-α和IL-2水平均升高,与A组和B组比较差异有统计学意义(P＜0.05),E组和F组 TNF-α和IL-2水平均降低,与C组比较差异有统计学意义(P＜0.05),D组和F组比较无统计学意义。心肌IRI后血瘀证兔炎症因子水平明显升高,而加味丹参饮可明显降低炎症因子水平。详见表1。

表1 各组兔 TNF-α和IL-2水平比较(±s)ng/mL

表1 各组兔 TNF-α和IL-2水平比较(±s)ng/mL

组别 n TNF-α IL-2 A组 10 1.21±0.67 2.56±0.51 B组 10 1.32±0.37 2.66±0.67 C组 10 2.92±0.361)2) 4.35±0.991)2)D组 10 1.96±0.381)2)3) 3.27±0.641)3)E组 10 2.44±0.371)2)3)4) 3.35±0.661)2)3)F组 10 2.30±0.251)2)3) 3.64±0.421)2)3)与A组比较,1)P＜0.05;与B组比较,2)P＜0.05;与C组比较,3)P＜0.05;与D组比较,4)P＜0.05

2.2 对心肌缺血再灌注损伤血瘀证兔心肌酶的影响 C组LDH和CK-MB均高于A组和B组(P＜0.05);E组和F组LDH和CK-MB均较C组明显降低(P＜0.05)。说明心肌IRI后血瘀证家兔心肌酶水平明显升高,而加味丹参饮可明显降低LDH和CK-MB的水平。详见表2。

表2 各组兔心肌酶水平比较(±s)U/L

表2 各组兔心肌酶水平比较(±s)U/L

组别 n LDH CK-M B A组 10 145.38±55.11 466.75±283.95 B组 10 168.75±84.44 502.88±262.84 C组 10 418.63±123.151)2) 1 088.00±155.471)2)D组 10 262.63±76.911)2)3) 539.13±171.282)3)E组 10 289.88±188.851)2)3) 744.88±243.311)2)3)4)F组 10 244.00±103.113) 752.00±119.111)2)3)与A组比较,1)P＜0.05;与B组比较,2)P＜0.05;与C组比较,3)P＜0.05;与D组比较,4)P＜0.05

3 讨 论

随着溶栓疗法、经皮穿刺冠状动脉腔内成形术(PTCA)、冠状动脉旁路搭桥术等广泛应用于临床,心肌缺血的治疗进入了再灌注时期,但在心肌得到血液再灌注后,不仅功能未得到恢复,反而使心肌损伤加重。炎症在心肌缺血再灌注损伤的发生与发展中起着重要作用,再灌注心肌是产生炎性细胞因子的主要来源[2],炎症损伤贯穿于心肌细胞损伤的全过程,随着再灌注的进行,大量活化的中性粒细胞聚集在心肌微血管并浸润到心肌组织中,通过释放细胞炎性物质引起心肌损伤。TNF-α和IL-2是重要的炎性细胞因子,在正常的心肌组织中它们含量很低,心肌IRI后数分钟由巨噬细胞和单核细胞等大量释放,过量的炎性细胞因子可通过第二信使通路蛋白激酶C(PKC)和丝裂原蛋白激酶(MAPKs)使核转录因子κ B(NF-κ B)得以活化而转核发挥其调控作用。NF-κ B活化能调控多种靶基因的表达,如黏附分子家族的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)等[3],在这些黏附分子作用下,白细胞在缺血区黏附、聚集,造成内皮损伤,血栓形成。同时,这些黏附分子又促使白细胞穿内皮迁移、浸润并损伤心肌[4]。沈波等[5]探讨趋化因子受体5(CCR5)抗体对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其作用机制,结果显示CCR5抗体可以通过抑制细胞因子 TNF-α从而阻止NF-κ B的早期活化而抑制ICAM-1表达、减少白细胞的黏附聚集从而对缺血再灌注心肌起到保护作用。陈玉东[6]探讨血清 TNF-α在兔心肌缺血再灌注中的动态变化及卡托普利的干预作用,结果显示TNF-α参与了心肌缺血再灌注的发生,卡普利在体内可能通过抑制 TNF-α的生成或释放,发挥心肌缺血再灌注损伤的保护作用。刘爱华等[7]探讨银杏酮酯(GBE50)预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及对炎症细胞因子和抗炎因子的影响,结论提示GBE50可能通过抑制炎性细胞因子、促进抗炎因子的表达,对心肌缺血再灌注后的炎症反应发挥调控作用。卢向航等[8]探讨延迟相吗啡预处理对兔心肌缺血再灌注损伤的保护机制,结果显示吗啡预处理延迟相可通过调控炎性细胞因子平衡发挥心肌保护作用。本实验建立血瘀证 IRI模型,观察到IRI后 TNF-α和IL-2水平均升高,这与以往研究一致,加味丹参饮组能明显降低TNF-α和IL-2水平,与IRI模型组比较有统计学意义(P＜0.05),与预处理组比较无统计学意义。本实验结果表明,加味丹参饮可以抑制心肌缺血再灌注时炎性递质激活,从而可以保护心肌 IRI。

心肌酶在正常生理状况下广泛存在于心肌细胞中,在心肌缺血后由于无氧代谢导致大量有害的物质如乳酸和氧自由基等在心肌中堆积,导致心肌细胞损伤,细胞膜通透性增加,使细胞内酶大量释放入血液,因此,临床常以血清心肌酶作为心肌损伤的重要指标。本实验中,IRI组LDH和CK-MB水平明显升高,而加味丹参饮能使LDH和CK-MB水平明显下降,与IRI组比较有统计学意义(P＜0.05),加味丹参饮能有效减少心肌酶外漏,从而对心肌损伤起着保护作用。

中医学虽然没有心肌 IRI这一病名,但根据其病变部位(心)和临床表现,应属于胸痹心痛、真心痛等范畴。中医理论认为,心肌IRI病位在心,中医辨证多属气虚血瘀,本虚标实之证。石高举等[9]探索活血化瘀类中药在防治冠心病心绞痛中的独特优势,其研究结果为临床上研究活血化瘀类中药在冠心病发病机制中的抗炎作用提供了有力的证据。孙晓莉等[10]应用生脉注射液对心肌缺血再灌注损伤家兔进行干预治疗,结果显示生脉注射液可通过调控细胞因子,拮抗全身炎症反应而保护心肌细胞,减轻心肌IRI。本课题在血瘀证基础上,建立 IRI模型,应用加味丹参饮预处理,陈修圆谓:“丹参饮治疗心痛、胃痛诸痛多效”。加味丹参饮主要用治于缺血性心脏病,病位在心不在胃,故去原方砂仁,加川芎、赤芍、当归、黄芪等药。黄芪补气培元,扶助心气。方中重用丹参,专入血分,内达脏腑而化瘀滞,檀香善入气分,行气化滞,生地、当归扶正濡养治本。全方益气活血,通络止痛。其可以通过降低炎症因子水平,防止心肌细胞损伤,至于其保护心肌IRI作用的深入机制有待进一步研究。

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