超高效液相色谱-串联质谱法测定4种麻痹性贝类毒素

张小军，陈雪昌，郭远明，梅光明，龙 举，薛 彬，郑 斌

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海水增养殖重点实验室，浙江舟山 316100；2.浙江省海洋开发研究院，浙江舟山 316000）

麻痹性贝类毒素(paralytic shellfish poisons,PSP)是目前世界上分布最广的一种贝类毒素[1]。目前在所有的贝类产品食物中毒事件中，麻痹性贝类中毒是公认的对健康危害最严重的类型之一。PSP中以石房蛤毒素（STX）、新石房蛤毒素（neoSTX）、脱氨甲酰基类毒素(neoSTX、dcneoSTX)最为常见。PSP在贝类体内呈结合状态，因而贝类摄入此毒素对自身不会造成危害；当人摄入含麻痹性贝类毒素的食物后，毒素会迅速释放并呈现毒性作用，潜伏期仅数分钟或数小时，症状包括四肢肌肉麻痹、头痛恶心、流涎发烧、皮疹等，严重的会导致呼吸停止[2]。

目前贝类毒素的检测方法有小鼠生物测定法[3-4]、电泳法[5]、高效液相色谱法[6-8]、液相色谱-串联质谱法[9-11]等。在这些检测方法中小鼠生物法是目前最常用的方法，由于小鼠生物法缺乏准确的定量性，且不能对具体毒素进行定性，从而限制了方法的应用；高效液相色谱-串联质谱法因其特异性好、灵敏度高等特点在近年来被用于麻痹性贝类毒素的测定。本研究利用超高效液相色谱-串联质谱法对4种麻痹性贝类毒素STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX进行研究，建立了分析速度快、灵敏度高、重现性好的测定方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

实验样品为贻贝，购自舟山市某水产品批发市场。

麻痹性贝类毒素标准品:STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX购自加拿大海洋生物科学研究所(NRC)；甲醇、乙腈、乙酸铵均为色谱纯；其余试剂均为分析纯；实验用水为超纯水。10 μg/mL PSP标准储备溶液：准确移取适量PSP标准溶液用3 mmol/L盐酸水溶液定容至100 mL，溶液-18℃保存。PSP标准使用液：将标准储备溶液用3 mmol/L盐酸水溶液逐级稀释获得适当浓度的混合标准使用液。

1.2 实验仪器

超高效液相色谱-串联四极杆质谱仪（ACQUITY UPLC／QUATTRO Premier XE，Waters公司）；匀浆机（T18，德国 IKA 公司）；漩涡混合器（MS2，德国 IKA 公司）；高速离心机(Centrifuge5810，Eppendorf公司)；氮吹仪（N-EVAP112，Organomation公司）；Waters OASIS HLB 固相萃取柱（3 cc/500 mg，Waters公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

称取5.0 g(精确至0.01 g)匀浆后的贝类试样至50 mL离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L乙酸后涡旋混匀30 s，超声提取5 min，然后5 000 r/min离心5 min，收集上清液于50 mL离心管中。Waters OASIS HLB固相萃取柱用3 mL甲醇、3 mL 0.03 mol/L乙酸水溶液活化，取5 mL上清液过柱，收集滤液过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱2.1 mm i.d.×50 mm 粒径1.7 μm；柱温40℃；样品温度10℃；进样量:10 μL；流速0.15 mL/min；流动相A为含2 mM乙酸铵和0.1%甲酸的水溶液，B为乙腈，以70%A和30%B等度洗脱。

1.3.3 质谱条件

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描；检测方式：多反应监测（MRM）；毛细管电压：3.5 kV；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：380℃；锥孔气流量：50 L/h；脱溶剂气流量：600 L/h；锥孔电压和碰撞能量等质谱多反应监测实验条件见表1。

表1 质谱多反应监测实验条件Tab.1 Conditions of multiple reaction monitoring(MRM)

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件选择

PSP是强极性化合物[1]，在普通的C18柱上保留较差，很难将各组分分离。UPLC虽然不能将PSP各组分完全分离，但可以将分析物和杂质分离，并将分析物富集。PSP在UPLC上分离富集后，由高特异性的串联质谱检测，仍可达到定量分析的目的。实验通过对不同浓度的甲酸和乙酸铵作为水相流动相研究比较，采用0.1%的甲酸和2 mM乙酸铵作为水相洗脱液，使PSP目标物在1 min内出峰，峰型尖锐，显著提高了灵敏度。STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX在贻贝样品中的加标质谱离子流图如图1所示。

将各PSP标准溶液以1.0 mg/kg的浓度进样进行质谱条件优化，以一级质谱扫描模式获得母离子的分子离子峰和锥孔电压；以子离子扫描模式进行子离子条件优化，获得定性、定量子离子和碰撞电压。优化后的母离子、子离子的质谱多反应监测参数见表1。

2.2 线性范围与检出限

用 STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX 标准使用液配制浓度分别为 2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的标准工作溶液，进样后制作标准曲线。4种PSP在2.0～50.0 μg/L范围内方法线性良好，线性相关系数为0.998 4～0.999 7。将加标浓度逐级稀释添加于样品中测定信噪比，最终按照10倍信噪比来确定该方法中STX、dc－STX、neoSTX、dcneoSTX 定量检出限均为 10.0 μg/kg。

2.3 回收率与精密度

以紫贻贝为基质，分别添加浓度为10.0、20.0、50.0 μg/kg的PSP进行回收率和精密度实验，实验结果见表2。该方法添加浓度在10.0～50.0 μg/kg之间的回收率为77.4%～90.8%，相对标准偏差为3.87%～6.37%，表明方法重现性好、精密度高，适用于贝类样品中麻痹性贝类毒素的检测。

图1 STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX在贻贝空白样品中加标20.0 μg/kg的色谱图Fig.1 Chromatogram of blank mussel spiked with STX,dcSTX,neoSTX and dcneoSTX at 20.0 μg/kg

表2 贻贝样品加标回收率和精密度Tab.2 Recovery and precision of the method from fortified mussel samples

3 结论

建立了STX、dcSTX、neoSTX、dcneoSTX 4种麻痹性贝类毒素的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，采用BEH C18色谱柱分离，串联质谱检测。方法分析速度快、灵敏度高、重现性好，可广泛适用于贝类中麻痹性贝类毒素的测定。

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