枸杞子水提物提取工艺优化及其对酪氨酸酶活性影响

刘 恋，黎 莉，方继德，吕 萌

(武汉工程大学化工与制药学院,绿色化工过程教育部重点实验室,湖北 武汉 430074)

0 引 言

枸杞为茄科Solanaceae枸杞属落叶灌木植物,是我国传统的药食兼用的名贵中药材,主要分布于我国西北地区，其中以宁夏枸杞的应用最为广泛.明朝李时珍在《本草纲目》中记载枸杞具有久服坚筋骨，补精气诸不足，明目安神，令人长寿等功效[1].现代科学研究表明,枸杞的药用和生物活性与其所含的多糖有很大关系，它具有调节免疫、清除自由基、抑制肿瘤、降血脂、降血糖、抗氧化和抗衰老等多方面的作用[2].

酪氨酸酶是皮肤黑色素生成过程中的关键酶，它具有催化酪氨酸并进一步氧化生成黑色素的作用.因此，可以应用酪氨酸酶抑制剂来抑制酪氨酸酶的活性，从而阻断黑色素的合成反应链[3].而宁夏枸杞水提物显著的抗氧化活性已得到相关的研究证明[4].另据文献报道，枸杞子水提物的抗氧化活性高于其经过纯化的多糖，这是因为枸杞子粗提物中含有类胡萝卜素、核黄素、抗坏血酸、硫氨素和烟酸等，这些物质可能也参与了抗氧化反应[5]；并且在相关文献中，还未见枸杞子影响酪氨酸酶活性的报道.因此，本实验对枸杞子采用水提法进行提取[6]，并运用酪氨酸酶氧化法测定枸杞子水提物对酪氨酸酶活性的影响.

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司生产；AB204-N型电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司生产；TD5-2台式低速多管架自动平衡离心机，长沙平凡仪器仪表有限公司生产；DZ-1BC型真空干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司生产.枸杞子购于宁夏银川市，经中南民族大学万定荣教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥成熟果实；无水葡萄糖(分析纯，国药集团化学试剂有限公司生产，T20090515)；熊果苷分析标准品(上海晶纯试剂有限公司生产，35648)；其它试剂均为分析纯.

1.2 方法

1.2.1 枸杞子水提物的提取工艺研究a.正交试验设计.参考相关文献[7]，选取料液比A，提取时间B，提取次数C作为三个考察因素，每个因素选择三个水平，采用L9(34)正交表进行试验，以提取所得的枸杞多糖质量分数为指标.因素水平表见表1.b.提取工艺.按表1排定的1号实验为例，称取一定量于50 ℃烘干的枸杞子，加10倍量蒸馏水，回流提取1次，每次提取时间为15 min.其余样品按正交表设定的条件进行实验.

表1 因素水平表

1.2.2 枸杞子水提物多糖的质量分数测定a.对照品溶液的配制.精密称取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖0.025 0 g于250 mL容量瓶中，加水溶解并定容，充分混匀.葡萄糖对照品溶液的浓度为0.1 mg/mL.b.显色剂的配制.称取蒽酮0.2 g置于棕色瓶中，再加入100 mL质量分数为95％的浓硫酸，充分溶解后待用.c.标准曲线的绘制.精密吸取5、10、15、20、25 mL葡萄糖对照品溶液0于5个50 mL容量瓶中，加水定容，分别配制浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL的葡萄糖对照品溶液.取5种不同浓度的葡萄糖对照品溶液各2 mL分别置于5支试管中，标号为1、2、3、4、5.再往5支试管中均加入4 mL显色剂，于100 ℃沸水浴中放置10 min，接着迅速放入冰水浴中冷却，然后室温放置8 min.以2 mL水加4 mL显色剂作为空白对照，在625 nm处测定吸光度[8].以浓度C(mg/mL)为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为A=55.961C-0.099 8R2=0.999 4.结果表明多糖浓度在0.003 3～0.016 7 mg/mL之间与吸光度有较好的线性关系.d.样品含量测定.将制备的枸杞子水提液经室温冷却后，于4 000 r/min离心10 min，然后用0.45 μm微孔滤膜过滤器过滤.精密吸取样品溶液1 mL，置于50 mL容量瓶中，加水定容.再按照“1.2.2”项c中的方法操作，测得的吸光度代入回归方程中计算样品的多糖含量.

1.2.3 酪氨酸酶活性影响的测定a.溶液的配制.缓冲液：用磷酸氢二钠和磷酸二氢钾配制成pH6.8的磷酸盐缓冲液；底物溶液：用L-酪氨酸配成浓度为0.1 mg/mL的溶液.酶溶液：称取适量酪氨酸酶溶于缓冲液中.b.酶活力测定.空白：取L-酪氨酸溶液0.35 mL，加入缓冲液0.4 mL，再加入纯净水0.75 mL；样品：取L-酪氨酸溶液0.35 mL，加入磷酸盐缓冲液0.4 mL，再加入纯净水0.25 mL.将空白和样品均放入30 ℃水浴锅中，保温10 min后取出，再往样品中加入酪氨酸酶溶液0.5 mL，迅速用紫外分光光度计检测其在317 nm处的吸光度变化，并连续记录3 min，得酶促反应曲线.c.抑制率测定.将在最佳工艺条件下制备的样品溶液于50 ℃真空干燥.精密称取一定量的干燥样品，分别置于6个容量瓶中，加水定容，配成浓度为0.08、0.26、0.79、1.12、2.24、5.08 mg/mL的6种不同质量浓度的样品溶液.按照“1.2.3”项b中的方法，分别测定这6份样品溶液对酪氨酸酶的抑制率.以不加样品液为空白对照，并以熊果苷分析标准品为阳性对照，测定酶相对的剩余活力.枸杞子水提物对酪氨酸酶的抑制率计算公式为：抑制率(％)=(A0-AI)/A0×100％，A0为无抑制剂时的酶活力，AI为有抑制剂时的酶活力.

2 结果与讨论

2.1 正交试验结果

正交试验结果见表2.从表2得出最佳提取工艺条件为A2B2C3.即在料液比为1∶20，提取时间为30 min，提取次数为3次的条件下，提取的多糖含量较高.由表2中的极差大小得知影响提取效果的主次因素顺序为：A>C>B，即料液比的影响最显著，其次为提取次数，最后为提取时间.

表2 正交试验结果

2.2 酪氨酸酶的酶促反应时间曲线

据文献报道，在波长317 nm处测定酪氨酸酶活力灵敏度较高[9].由图1可看出，0～1 min吸光度变化较明显，曲线上升幅度较大，之后2 min吸光度变化较小，曲线上升趋势减缓.

图1 吸光度与时间的关系曲线

2.3 枸杞子水提物对酪氨酸酶的抑制作用

枸杞子水提物对酪氨酸酶活性的影响见图2，枸杞子水提物对酪氨酸酶具有明显的抑制作用，并对酪氨酸酶的抑制效率随着样品质量浓度的增加而增强.由曲线所得的回归方程为：Y=-19.482ln(x)+43.890；R2=0.992 4.通过回归方程计算得出：枸杞子水提物对酪氨酸酶抑制率为50％时的质量浓度为0.73 mg/mL.同样方法测定熊果苷的IC50为0.28 mg/mL.

图2 抑制率与样品浓度的关系曲线

3 结 语

近年来，国内外学者对枸杞的提取纯化、组分分离以及生物活性等方面进行了深入的研究，为枸杞多糖的进一步开发和利用奠定了基础[10].然而迄今为止，枸杞仍主要是作为食用保健品被广泛应用.因此，如何根据现代实验研究的结果，并结合中医药理论知识，对枸杞其它方面的药理作用进行更加深入地研究，如用于研究色素沉着性皮肤病的治疗，还有待进一步地探讨.本实验已证明枸杞子水提物对酪氨酸酶催化酪氨酸形成多巴的过程具有明显的抑制作用，这将为枸杞子水提物作为一种新型酪氨酸酶抑制剂提供了一定的实验依据.

参考文献：

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[2]王金章,王秀娟.枸杞子的化学成分和药理研究概况[J].天津药学,1999,11(3):14-16.

[3]丁大鹏,马文丽,郑文岭.酪氨酸酶抑制剂的研究进展[J].实用医学杂志,2005,21(12):1364-1365.

[4]Wu S J,Ng L T,Lin C C.Antioxidant activities of some common ingredients of traditional chinese medicine,Angelica sinensis,Lycium barbarum and Poria cocos[J].Phytother Res,2004,18(12):1008-1012.

[5]Luo Qiong,Cai Yi Zhong,Yan Jun,et al.Hypoglycemic and hypolipidemic effects and antioxidant activity of fruit extracts from Lycium barbarum[J].Life Sciences,2004,76(2):137-149.

[6]Cai Yi Zhong,Luo Qiong,Sun Mei,et al.Antioxidant activity and phenolic compounds of 112 traditional Chinese medicinal plants associated with anticancer[J].Life Sciences,2004,74(6):2157-2184.

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[9]蒋萌蒙,田呈瑞,王向军.双孢蘑菇中酪氨酸酶的特性[J].江苏农业学报,2008,24(2):194-198.

[10]魏永祥,商希礼.枸杞多糖的研究进展[J].安徽农业科学,2010,38(11):5834-5836.