中药胃肠舒对Ca2+信号传导途径的调控*

宋晓冬，王美蓉，张瑾锦，刘文波

(滨州医学院实验中心，山东 烟台 264003)

胃肠运动障碍型疾病是临床多发病，多与胃肠蠕动功能减弱有关，其病理生理基础为胃排空延迟及小肠传输功能障碍，但其发病机制尚不清楚[1-4]。从中医学观点看胃肠运动障碍型疾病，多由于脾胃功能失调，升降失司，气机不畅所致。治疗重在调理脾胃功能，协调升降，舒畅气机。本课题组人员研制的胃肠舒，前期实验证明胃肠舒对胃轻瘫综合征的疗效优于吗丁啉，是妇科手术后胃肠功能恢复的良药，对小鼠子宫切除术后肠道推进作用优于西沙必利。本实验选取SD大鼠构建食积动物模型，不同浓度胃肠舒灌胃后，测定胃肠舒对肠组织的推动作用及其对肠组织动能和神经递质的影响，初步探讨了胃肠舒促进胃肠运动中Ca2+的调控。

1 材料与方法

1.1 肠推进实验

取禁食24h的正常大鼠随机分组，正常对照组用1%卡红生理盐水溶液，西沙必利组用1%卡红西沙必利溶液，胃肠舒Ⅰ、Ⅱ组用1%卡红胃肠舒溶液分别灌胃。50min后将大鼠断头处死、立即剖腹，观察胃肠蠕动及膨胀情况并取出肠管，测量幽门至卡红前沿的距离作为卡红肠内推进距离，测量幽门至肛门的距离作为全肠长度，用公式计算卡红推进百分率:卡红推进率=卡红肠内推进距离(cm)÷全肠长度(cm)×100%。

1.2 离体肠道平滑肌的收缩

取正常大鼠随机分组，断头处死，立即剖腹取回肠置冷台氏液中，制备长2cm的肠段，标本悬吊于盛有台氏液(37℃ ±5℃，通氧)的离体器官浴槽中，静息负荷3g，平衡15min，通过张力换能器，生物信号处理系统进行平滑肌张力检测，分别向胃肠舒组器官浴槽中加入胃肠舒溶液，向西沙必利组器官浴槽中加入西沙必利溶液，采集给药前、后肠道平滑肌自发活动的曲线，分别选1min内曲线进行处理计算，求出平均频率与幅度(定标:输入1g张力，曲线Y轴移动1格，代表30mv)。

1.3 肠组织一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)和胆碱乙酰化酶(Choline acetylase，ChAT)的表达

标准SD大鼠(体重200g～230g)由烟台绿叶实验动物中心提供，SD大鼠50只随机分为正常组、模型组、西沙比利组、胃肠舒1组(75g/l，10ml/kg)、胃肠舒II组(150 g/l，10ml/kg)5组，每组10只。除正常组外，其余4组均制备食积动物模型，食积动物给予高蛋白、高热量饲料(由鱼粉、豆粉、面粉、牛奶粉按1∶2∶1∶1比例配成)饲养，自由摄食和饮水，从第2天加喂25%浓度的牛奶，每次7ml，每日2次。正常对照组喂养等量自来水，均连续7d，从第8天开始各组给药实验。动物饲养各组环境与条件均相同，造模组除造模期间外，各组均给予同样常规饲料与自来水喂养。造模期间，检测记录大鼠体质量、腹围、粪便、饮水及食物摄取情况，剔除不合要求的大鼠，食积模型成功后开始给药实验。正常对照组不给任何药物，模型组给予生理盐水20ml/(kg·d)灌胃，其他各组胃肠舒片剂碾磨成粉剂后配成等溶量药液，7d后取大鼠空肠组织石蜡包埋。选取大鼠空肠石蜡切片脱蜡至水，3%H2O2甲醇室温孵育30min，0.01mol/L枸橼酸盐缓冲液(PH6.0)微波炉内抗原修复。PBS洗3次。10%正常山羊血清封闭，孵育30min。倾去血清，勿洗，分别滴加兔抗大鼠NOS多克隆抗体和小鼠抗大鼠ChAT单克隆抗体，4℃过夜。分别滴加山羊抗兔 IgG和羊抗小鼠IgG二抗孵育。PBS冲洗，滴加辣根酶标记链霉卵白素后，DAB显色剂显色10min。自来水充分冲洗，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明、封片。

1.4 肠平滑肌细胞ATP含量的检测

根据参考文献[5]改进，解剖显微镜下剥离选取大鼠肠纵肌层和环肌层组织进行平滑肌细胞原代培养，至细胞第4代收集，加入1ml ATP检测裂解液后用玻璃匀浆器裂解匀浆后，4℃ 12000r/min离心10min，取适量上清放于96孔板，用于测定 Celltiter-GloTM试剂盒A液和B液混合，室温下静置1h后，向各实验组中每孔加入100ul Celltiter-GloTM混合液，5min后酶标仪检测(波长562nm)。

1.5 肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的测定

平滑肌细胞原代培养至细胞第4代收集，加入2倍体积组织线粒体分离试剂盒中的A液，重悬组织，800r/min离心20s，沉淀组织样品，弃上清。再加入8倍体积预冷的组织线粒体分离试剂盒中的A液，冰上进行匀浆，匀浆20～30次后，匀浆物在4℃ 800r/min离心5min。小心把上清转移到另一离心管中，4℃12000r/min离心10min。小心去除上清，沉淀即为分离得到的组织线粒体，加入适量线粒体储存液，重悬线粒体，备用。将待测线粒体按照实验分组置于Ep管中，加入终浓度为1mg/l的 Rhodamine123，放入37℃孵箱里静置培养45min。PBS清洗2次并重悬，流式细胞仪(Beckman Coulter，Inc，America)检测(激发波长488nm、发射波长525nm)。

1.6 肠平滑肌细胞Ca2+浓度测定

平滑肌细胞原代培养至细胞第4代收集，常温离心洗涤950r/min×5min×3次，弃上清液。避光加入50μl浓度为10μmol/L的 Fura-2AM，37℃避光孵育负载细胞 40min～50min，轻轻摇动，950r/min离心5min终止孵育，弃上清液。在沉淀中加入DHanks液，离心洗涤950r×5min×3次，洗去胞外残存的 Fura-2AM，弃上清液。D-Hanks液吹打为悬液，滴片，室温下进行激光扫描共聚焦显微镜(Leica Company，Germany)检测(激发波长为340nm，发射波长为510nm)。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 胃肠舒对大鼠肠组织的作用

表1显示，在大鼠肠推进实验中，大鼠处死后剖腹肉眼可见西沙必利组和胃肠舒组的大鼠胃肠蠕动加快，肠膨胀明显，胃肠舒组的卡红推进率显著高于正常组(P＜0.05)，与西沙必利组相比没有统计学意义。表2显示，从胃肠舒对大鼠离体肠平滑肌张力检测的结果看，胃肠舒组和西沙比利组均能使肠道平滑肌自发活动的收缩幅度加大，差异有显著性(P＜0.05)，但对收缩频率无影响(P＞0.05)。

表1 大鼠各实验组肠推进率检测(s，n=10)

表1 大鼠各实验组肠推进率检测(s，n=10)

注:与正常组比较:*P＜0.05

组 别卡红推进距离(cm)全肠长度(cm)卡红推进率(%)36.7±0.21 57.0±0.12 65.0±0.20西沙必利组 43.8±0.27 56.1±0.17 78.2±0.17胃肠舒Ⅰ组 44.7±0.35 57.1±0.24 78.3±0.22*胃肠舒Ⅱ组 49.2±0.37 59.0±0.32 84.1±0.37正常组*

2.2 胃肠舒对大鼠肠组织神经递质的作用

免疫组化结果显示，ChAT和NOS阳性神经元呈棕色，胃肠舒各组与正常组比较空肠NOS阳性率显著减少(图1、表3)，空肠肌间神经丛 ChAT阳性神经含量较正常组显著增加(图2、表3)。

表2 大鼠离体肠道平滑肌的收缩频率和幅度(s，n=10)

表2 大鼠离体肠道平滑肌的收缩频率和幅度(s，n=10)

注:与用药前比较:*P＜0.05

组 别 频率(次/min)幅度(mv)药前 药后 药前 药后 差值正 常 组15.9±1.7 60.6±17.3西沙必利组 16.2±1.2 15.8±1.5 52.6±6.2 66.6± 8.5 14.9±2.5*胃肠舒Ⅰ组 16.7±1.1 16.3±1.3 66.0±18.2 82.8±14.5 16.8±5.9*胃肠舒Ⅱ组 16.3±1.1 15.7±1.3 56.0±18.2 81.7±13.7 25.7±6.1*

2.4 胃肠舒对大鼠肠平滑肌细胞动能的影响

大鼠肠组织ATP含量检测结果显示，胃肠舒组和西沙必利组均能显著增高肠平滑肌细胞ATP的含量，ATP的改变量与对照组比较差异显著(P＜0.05，图3)。细胞荧光分析图纵轴表示细胞数量，横轴表示荧光强度，主峰右移表示荧光强度增强，线粒体跨膜电位升高。荧光强度越大，表示线粒体跨膜电位越高，反之则低。细胞荧光分析图显示，胃肠舒组主峰与正常对照组相比右移幅度大，比西沙必利组右移幅度也大，预示胃肠舒组改变线粒体跨膜电位的幅度大(图4)。激光共聚焦显微镜下检测到胃肠舒组平滑肌细胞Ca2+流高于空白对照组和西沙必利组(P＜0.05，图5-6)，且随着胃肠舒用药浓度的加大，胃肠舒改变 ATP的含量加大，对线粒体跨膜电位改变幅度增大，对Ca2+流的影响也越大。

图1 免疫组化法观察胃肠舒对大鼠肠组织NOS的影响(×200)

图2 免疫组化法观察胃肠舒对大鼠肠组织ChAT的影响(×200)a:正常组;b:模型组;c:西沙必利组;d:胃肠舒Ⅰ组;e:胃肠舒Ⅱ组

表3 NOS、ChAT检测光密度值比较(s，n=10)

表3 NOS、ChAT检测光密度值比较(s，n=10)

注:与正常组比较:*P＜0.05

组别NOS ChAT正 常 组185.38±17.73 295.22±36.71模 型 组 394.54±57.32 123.33±32.84西 沙 比 利 组 271.64±34.31 232.31±41.65胃 肠 舒 Ⅰ 组 280.37±53.64* 220.72±53.12*胃 肠 舒 II组 270.21±51.72* 243.54±41.12*

图3 大鼠各实验组肠组织ATP的含量

图4 流式细胞仪检测胃肠舒对大鼠肠平滑肌细胞线粒体跨膜电位的影响

3 讨论

从中医学观点看，无论在生理、病理上，胃肠运动与气机升降，尤其脾胃气机的升降都有着直接的相关性，气机升降协调是胃肠协调运动的前提条件，气机升降失调是胃肠动力障碍性疾病的主要病机。本课题组研发的复方中药胃肠舒主要的单味中药是大黄、枳壳、甘草。据《本草纲目》记载，大黄能下瘀血血闭，寒热，留饮宿食，荡涤肠胃，推陈致新，通利水谷，调中化食，安和五脏。枳壳能健脾开胃，调五脏，下气，止呕逆，消痰，行滞消胀，痞满胀痛，食积不消。甘草主治脾胃虚弱，倦怠乏力，缓和药物毒性、烈性。在胃肠舒复方中大黄通胃肠腑气，泻胃肠积滞为君药;枳壳实行气消胀，破积除满为臣药;甘草健脾益气，甘缓和中，调和诸药，防大黄攻下伤正为佐使。故诸药相互配伍，具有调和脾胃升降，疏通胃肠气机的功效，使肠胃升降功能得以恢复而达到治疗目的。

图5 激光共聚焦显微镜观察胃肠舒对大鼠肠平滑肌细胞Ca2+的影响

图6 Ca2+光密度值各组比较

从现代医学观点看，胃肠运动障碍型疾病多由胃肠运动功能失调，能量供应不足导致胃排空时间延长所致。线粒体是真核细胞能量转换的主要场所，是细胞生成ATP的主要地点。线粒体基质的三羧酸循环酶系通过底物脱氢氧化生成NADH，NADH通过线粒体内膜呼吸链氧化。与此同时，导致跨膜质子移位形成跨膜质子梯度和/或跨膜电位。线粒体内膜上的ATP合成酶利用跨膜电位合成ATP。合成的ATP通过线粒体内膜ADP/ATP载体与细胞质中ADP交换进入细胞质，参与细胞的各种需能过程。因此，线粒体跨膜电位和ATP的变化直接影响着细胞的动能，继而会影响到相应组织的运动能力[6-8]。通常线粒体跨膜电位和 ATP水平的升高表明，线粒体功能增强，能量供应充足，动能增加，细胞/组织运动能力加强。

本研究数据显示，现代医学的观点和中医学的观点是相辅相成的。动物实验表明，胃肠舒能促进大鼠肠蠕动，加快肠推进和肠平滑肌收缩幅度。从检测的线粒体跨膜电位和ATP结果推测，胃肠舒可能通过加大线粒体跨膜电位和ATP，从而增加肠组织的动能而达到促进肠蠕动的作用。NO由NOS催化合成，作为NO合成的酶，NOS在胃肠道广泛存在。由于NO没有专门的储存及释放调节机制，靶细胞上NO的多少直接与NOS的合成有关，Ach也很不稳定。因此本实验通过 NOS和 ChAT的检测来反映NO和Ach的表达。实验数据显示，在胃肠舒增大肠组织动能时，兴奋性神经递质Ach和抑制性神经递质NO可能参与其中，胃肠舒增强Ach表达的同时抑制了NO的表达，Ach和NO的这种变化可能是胃肠舒增大平滑肌Ca2+流的缘故。

从本研究数据分析，胃肠舒调控胃肠运动的可能机制之一是通过Ca2+信号传导途径实现的，平滑肌细胞胞浆游离Ca2+在平滑肌细胞收缩与舒张过程中起重要的“第二信使”作用。一般认为，平滑肌收缩和舒张活动与胞内钙离子浓度变化密切相关:高浓度Ca2+引起平滑肌收缩，低浓度Ca2+引起平滑肌舒张，Ca2+的工作浓度通过质膜和肌质网膜的移动调节完成。胃肠舒对Ach和NO的作用，一方面使Ach促进平滑肌膜对 Ca2+的通透，另一方面使NO通过cAMP介导抑制 Ca2+通道，前者使 Ca2+浓度升高，后者使 Ca2+浓度降低，在两者的共同作用下Ca2+浓度发生变化，Ca2+浓度的升高也促使线粒体跨膜电位升高，从而促使ATP的生成。再者Ca2+可以与钙调蛋白结合，Ca2+-钙调蛋白激活ATP酶，分解ATP产生能量，导致平滑肌收缩，从而促进了肠蠕动。

当然肠蠕动中还受到其他诸多因素的影响，尚待进一步研究。本研究数据阐释了Ca2+信号传导途径在中药促胃肠运动中的调控机制，为中药胃肠舒广泛应用于临床提供了理论依据，为设计新的促胃肠运动中药提供了思路和方案。

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