盐酸普罗帕酮在中毒大鼠体内的死后再分布研究1)

刘永涛,姜 涛,贠克明

普罗帕酮(Propafenone,PPF),又名丙苯酮(Bexarytmon),主要用于致命性室性心律失常,也有致心律失常作用,常引起中毒死亡[1-9]。普罗帕酮脂溶性强,表观分布容积较大,从理论上讲易发生死后再分布[10,11]。有关普罗帕酮死后再分布的研究未见报道。本文采用大鼠群体模型研究盐酸普罗帕酮在中毒大鼠体内的死后再分布规律,为普罗帕酮中毒的法医学鉴定提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与药品 PPF标准药品:盐酸普罗帕酮(纯度98%)购自中国药品和生物制品检验鉴定所,其余为分析纯。标准液:500 μ g/mL,盐酸普罗帕酮对照乙醇溶液,4℃冰箱保存。盐酸普罗帕酮片剂:每片50 mg,产地上海医药集团有限公司信宜制药总厂(批号:051003)

1.2 实验动物 Wistar大鼠,雄性,30只,体重200 g±10 g。

1.3 主要仪器检测条件 CS-930薄层色谱扫描仪:光谱扫描:Difference扫描方式;色谱扫描:单波长锯齿扫描,λ 1=304 nm,λ 2=360 nm,SX=3,记录峰面积。

1.4 薄层层析条件 薄层板:HSGF254 10 cm×10 cm×0.25 mm;展开剂∶正庚烷∶三氯甲烷∶无水乙醇∶乙酸乙酯∶甲醇(5∶2∶2.5∶1.5∶2.5),500 μ L 浓氨水饱和10 min,上行展开5 cm～7cm。

1.5 实验动物模型 雄性大鼠30只,称重,按PPF LD50(0.876 g/kg)灌胃,观察表现。灌胃后2 h处死。置于20℃保存,于不同时间(0、4 h、8 h、24 h、48 h、72 h)随机取 4 只解剖,取脑、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、心血和外周血,按下述方法检测其中PPF含量。

1.6 薄层扫描响应曲线和扫描精度 取 PPF标准(0.1 μ g、0.2 μ g 、0.4 μ g 、1.0 μ g 、2.0 μ g 、4.0 μ g 、8.0 μ g 、12.0 μ g 、16.0 μ g)点板,展开,扫描,已斑点内 PPF含量(X,μ g/斑点)和斑点扫描面积积分值(Y)进行回归,建立PPF薄层扫描响应曲线。以PPF标准溶液(1.0μ g、4.0 μ g)同一薄层板和不同薄层板重复点样,展开。一次扫描,计算板内和板间扫描(面积)精密度;同一斑点日内不同时间重复扫描5次,计算日内扫描(面积)精密度。

1.7 检材处理 取待测组织匀浆(1∶3)1 mL或血液250 μ L,同时取空白检材两份(肝或血液),加入PPF标准溶液 8 μ L和16μL;加入蒸馏水 1 mL、pH=11硼酸-碳酸钠缓冲液 1 mL、乙醚5 mL,震荡15 min,1 800转离心5 min,分离有机层。乙醚5 mL重新萃取一次;合并萃取液,40℃水浴氮气流下挥干。25 μ L乙醇定容,取 20 μ L 点样。

1.8 工作曲线 取待测组织匀浆1 mL和血液250μ L各9份,分别加入 0.125 μ g、0.25 μ g、0.5 μ g 、1 μ g、2.5 μ g、5 μ g、10 μ g、15μ g、20μ g PPF,按前述方法提取展开和扫描。以斑点扫描面积积分值(X)和PPF含量(Y,μ g/mL)进行回归,建立标准曲线回归方程,确定线性检测范围和最低检出浓度。

1.9 回收率 分别于2 mL空白检材中添加不同剂量PPF,按1.7、1.4项提取、展开、扫描,标准曲线法检测样品中 PPF浓度,计算回收率。

1.10 样品检测 按1.7项提取,展开后,紫外灯下确定斑点位置,光谱扫描结合Rf值定性,色谱扫描外标两点法或工作曲线法定量。

1.11 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 薄层色谱 PPF薄层层析Rf值为0.45;光谱扫描吸收波长为210 nm,250 nm,310 nm;色谱扫描显示PPF斑点扫描峰形对称,PPF与检材提取物中杂质完全分离。采用碘化铋钾显色,PPF斑点呈橙黄色,灵敏度为每斑0.1 μ g。

2.2 薄层扫描响应曲线和扫描精密度 PPF薄层扫描响应曲线回归方程为:Y=12 539X+19 803(r=0.9869,P＜0.05),线性响应范围为每斑点 0.2 μ g～8 μ g,最小检出量为每斑点 0.1 μ g。PPF的板内扫描精密度 RSD(n=5)为 4.1%和 2.7%;日内扫描精密度RSD(n=5)为3.4%和4.2%。

2.3 工作曲线 血中PPF检测工作曲线回归方程为:Y=-0.694+4.582×10-5X(r=0.9992)。线性检测范围为 0.1～6 μ g/mL,最小检出浓度 0.05 μ g/mL 。肝中 PPF检测工作曲线回归方程为:Y=-0.743+4.823×10-5X(r=0.9782)。线性检测范围为(0.1～6)μ g/mL,最小检出浓度0.1μ g/mL。

2.4 提取回收率 空白血中添加PPF的提取回收率为101.5%±3.7%(0.5μ g/mL,n=5),96.4%±3.2%(2μ g/mL,n=5),94.4%±3.0%(4μ g/mL,n=5)。空白肝中添加PPF的提取回收率为 91.2%±4.6%(0.5 μ g/mL,n=5),89.7%±5.1%(2 μ g/mL,n=5),86.4%±5.3%(4 μ g/mL,n=5)。

2.5 灌胃后大鼠中毒反应 30只大鼠按LD50(0.876 g/kg)剂量灌胃后,30 min内即出现抽搐、站立不稳,呼吸困难、心跳加快等症状,6只大鼠抽搐后死亡,未死大鼠抽搐现象在1 h～2 h内有不同程度缓解。

2.6 死亡当时大鼠体内PPF含量

2.7 死后不同时间各组织中脏器和体液PPF含量(见表1)20℃保存8 h后大鼠心血中PPF含量明显升高(P＜0.05);48 h后外周血中PPF含量明显降低(P＜0.05)。

表1 死后不同时间各组织中脏器和体液PPF含量(±s)μ g/mL

表1 死后不同时间各组织中脏器和体液PPF含量(±s)μ g/mL

检材 死亡当时 4 h 8 h 24 h 48 h 72 h脑1.545±0.1431) 1.615±0.127 1.738±0.178 1.615±0.134 1.533±0.139 1.437±0.113心肌 5.668±0.4681) 5.665±0.441 7.525±0.693 6.054±0.753 5.406±0.470 5.146±0.432肺28.327±2.3051) 29.890±3.166 32.439±2.992 27.110±5.366 29.659±2.874 26.415±3.063肝4.377±0.8671) 5.165±0.586 6.383±0.612 5.263±0.617 4.834±1.028 4.595±0.938脾13.722±1.1281) 14.081±1.181 14.713±1.491 13.634±0.681 14.137±2.693 13.737±1.882肾7.183±0.855 7.761±0.988 8.618±1.003 7.556±1.076 7.352±0.778 7.352±1.022肌肉 0.935±0.099 0.961±0.163 1.026±0.065 0.963±0.064 0.914±0.092 0.906±0.041心血 6.444±0.596 6.967±1.697 8.622±1.1332) 7.027±0.553 6.664±0.405 6.371±0.774外周血 6.630±0.7111) 7.114±0.890 7.861±0.711 6.211±1.138 5.432±0.0932) 4.045±0.998与同时刻肌肉比较,1)P＜0.05;脏器和体液药物含量与死亡当时药物含量相比,2)P＜0.05

3 讨 论

中毒死后药(毒)物浓度不一定反应死亡当时的药物浓度,死后再分布对死后体内药(毒)物浓度的影响越来越受到重视。许多药物都存在死后再分布,碱性、亲脂性毒物具有较大的分布容积(Vd),毒物容易发生死后再分布现象[10,11]。PPF脂溶性较强,口服吸收快,分布、消除慢[12],应较易发生死后再分布,但目前尚未见报道。

本实验结果显示,死后20℃保存8 h心血中PPF含量显著升高。说明PPF在中毒大鼠体内存在死后再分布现象。一般认为,死后再分布的形成机制有顺梯度浓度扩散、死后循环、毒物的降解和破坏及微生物的作用[13]。顺梯度浓度扩散,包括死后毒物从富集器官或组织逐渐释放扩散到邻近组织和肠道中残留毒物扩散到周围组织,这可能是毒物死后再分布的主要机制[13]。本实验结果显示,灌胃后2 h肺组织中PPF含量(28.327±2.30)μ g/g,达其心血中含量(6.444±0.596)μ g/g的4.4倍,顺梯度浓度扩散可能是其死后再分布的主要机制之一,但还需进一步实验证实。

因此,对盐酸普罗帕酮中毒和死亡案件进行法医学鉴定时,应在8 h内进行尸检,不能及时测尸检时,应及时冷冻保存尸体,分析毒物结果时应考虑到死后再分布对血中PPF含量的影响。

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