不同脱细胞方法对周围神经生物力学性能的影响

杨 召 马信龙，* 李秀兰 马剑雄 张 杨 郭洪刚 孙晓雷

1(天津医科大学总医院骨科，天津 300052)

2(天津医院骨科，天津 300211)

引言

目前，交通伤、战争及自然灾害所引发的周围神经损伤给患者带来了高致残率，并给社会及患者家庭带来了巨大的经济负担，这些都使得周围神经损伤成为全球所面临的严峻的健康问题之一［1］。如何寻求理想的周围神经替代移植物来提高周围神经的再生与愈合及重建肢体功能，成为困扰外科医师的临床难题。

近年来，随着神经细胞学、分子生物学的深入研究，特别是组织工程学的迅猛发展，为组织工程化神经移植物的研发启示了新的方向，组织工程化神经移植物应用于周围神经再生已逐渐成为研究的焦点［2］。组织工程化神经移植物主要包括:有活性的种子细胞和有良好生物相容性的支架材料。其中，支架材料被视为神经源性种子细胞赖以生存的物理环境，不仅为种子细胞提供附着场所，而且为细胞提供结构支撑作用，并抗击压力等外力，在体内维持组织形状，因此，支架材料本身应具有一定的生物力学特性。脱细胞神经支架现已在实验模型中广泛应用，但是国内外学者对于脱细胞神经支架生物力学性能的报道却极为罕见。所以本实验的目的就是研究脱细胞神经支架在生物力学性能方面的差异，为组织工程化神经构建和临床神经修复提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

17只3月龄雄性Wistar大鼠(天津医院动物实验室，天津)，体重:220～230g，动物等级为清洁级。

1.2 试剂及仪器

Triton X-200，SB-10，SB-16(Sigma 公司，美国)，软组织生物力学测试专用冰冻卡具(Cooling capacity walts，Bose公司)、Endura TEC ELF 3200 力学实验仪器(Bose公司，美国)及其配套的 Wintest生物力学测试软件，万分之一精密电子天平(北京光学仪器厂，北京)、闭式四用游标卡尺(广陆牌，141-102)、平板振荡器(江苏省荣华仪器制造有限公司，江苏)、电热三用水箱(北京医疗设备厂，北京)、光学显微镜(Nikon公司，日本)、场发射扫描电镜(LEO，德国)。

1.3 方法

1.3.1 实验分组

实验动物采用10%水合氯醛0.5 mL/100 g腹腔注射麻醉，切取大鼠双侧坐骨神经，手术显微镜下去除神经外膜上附着的脂肪组织，取20 mm长坐骨神经，共34条。随机分为3组，A组为正常对照组，B组为物理冻融组，C组为化学萃取组。

A组(10条):神经组织不作任何处理，取出后立即置于PBS中备用;B组(10条):神经组织置于洁净1.5mL塑料离心管中密封，液氮中冰冻3 min，取出后立即置于37℃水浴中3 min，重复此过程5次，制成冻融的坐骨神经［3］;C组(14条):于25℃条件下将神经组织置于灭菌蒸馏水中低渗处理7 h，振荡器持续振荡，速率80次/min;125 mmol/L SB-10溶液浸泡15 h;灭菌 PBS中振荡 15 min;0.6 mmol/L SB-16、0.14%Triton X-200溶液浸泡24 h;灭菌PBS中振荡3次(5 min/次);125 mmol/L SB-10溶液浸泡7 h;灭菌 PBS中振荡 15 min;0.6 mmol/L SB-16、0.14%TritonX-200溶液中浸泡15 h;灭菌PBS中振荡3次(5 min/次)［4］。所有步骤均在室温下完成。

1.4 组织学观察

1.4.1 HE染色

每组随机选取1条坐骨神经，修剪为5 mm的小段，10%甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm厚横、纵切片行HE染色，光镜下观察神经细胞、髓鞘、轴突及神经基底膜等结构。

1.4.2 场发射扫描电镜

每组随机选取1条坐骨神经，修剪为5 mm的小段，4%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，临界点干燥，真空喷金镀膜，场发射扫描电镜下观察神经横断面，了解神经细胞、髓鞘、轴突及神经基底膜等结构的变化。

1.5 生物力学测试

将其余样本固定于力学仪器冰冻卡具中部，5 min后旋紧卡具确保神经不会有各向滑动，而两卡具间外露的神经仍为常温，不会影响其拉伸时的生物力学性能。设定初始长度为10 mm，每一个标本以1 mm/min被恒速拉伸，拉力和位移每秒被取样5次。每个样本被拉伸至完全断裂。在测试过程中用生理盐水保持样本湿润。读取极限载荷(载荷-位移曲线中的最高点力值);读出每个测试点载荷与其对应的位移值，计算出韧度(载荷-位移曲线中直线部分的斜率)=载荷/位移(N/mm);极限应力=极限载荷/面积 (MPa);极限应变 =极限载荷对应的位移/样本的初长度;弹性模量 =应力/应变(MPa);断裂功耗=载荷-位移曲线中极限载荷点左侧曲线下的面积。示例见图1。

图1 载荷-位移曲线示意图Fig.1 Diagram of load-displacement curve

梯形面积求和计算公式

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 HE染色

A组神经纤维横断面呈大小不一的圆形，细胞核清晰，髓鞘外周淡染呈网格状结构;纵切面上可观察到轴突、雪旺细胞及细胞外基质等结构，见图2中(a)和(b);B组横、纵切片上含有较多的雪旺细胞，轴突及髓鞘等绝大部分存在，但结构紊乱，见图3中(a)和(b));而C组在横切片上轴突及细胞均消失，代之以神经内膜形成的不规则圆形空腔;纵切片上也见不到任何细胞，神经内膜呈波浪状纵形排列，轴突、髓鞘结构消失而形成管柱状空隙，见图4中(a)和(b)。

图2 A组神经的HE染色(400×)。(a)横切面;(b)纵切面Fig.2 The HE staining of nerve in group A.(HE staining，400×).(a)cross section;(b)longitudinal section

2.2 场发射扫描电镜

A组神经纤维粗细不一，中央为轴突，四周髓鞘包围，神经纤维表面有结缔组织形成的神经内膜包绕髓鞘、轴突等内容物形态清晰，见图5;B组:神经轴突、髓鞘、雪旺细胞变性、坏死，轴突崩裂，髓鞘裂解，堵塞基底膜管管腔，见图6;C组髓鞘、轴突等结构均消失，可见雪旺细胞基底膜管，基底膜管内未见残留结构，官腔通畅，见图7。

2.3 极限载荷、极限应力、极限应变

极限载荷:直接反映神经的强度。三组中，B组的极限载荷最大，A组次之，C组最小，但三组间的差异无统计学意义(F=0.154，P=0.332)。

极限应力:作用在单位面积上的最大应力，排除了神经面积差异。3组中，B组的极限应力最大，A组次之，C组最小，但3组间的差异无统计学意义(F=1.381，P=0.270)。

图3 B组神经的 HE染色(400×)。(a)横切面;(b)纵切面Fig.3 The HE staining of nerve in group B.(HE staining，400 ×).(a)cross section;(b)longitudinal section

极限应变:它是某一方向上样本在极限载荷时因变形产生的长度增量与初长度的比值。3组中，A组的极限应变最大，C组次之，B组最小，但3组间的差异无统计学意义(F=0.317，P=0.731)。

2.4 韧度、弹性模量

2.4.1 韧度

类似于胡克定律中的常数k，代表神经抗形变、抗断裂的特性，决定于神经本身，能直观反映神经的“松散”或“坚韧”。3组中，B组的韧度最大，C组次之，A组最小，3组间两两比较，A组和 B组间的韧度有统计学差异(P=0.039)，其余无统计学差异(F=2.225，P=0.129)。

2.4.2 弹性模量

表示神经抗形变、抗断裂的特性，也是神经内在本质的参数。3组中，B组的弹性模量最大，C次之，A组最小，3组间两两比较，A组和B组间的弹性模量有统计学差异(P=0.014)，其余无统计学差异(F=3.426，P=0.048)。

图4 C组神经的HE染色(400×)。(a)横切面;(b)纵切面Fig.4 The HE staining of nerve in group C(HE staining，400×).(a)cross section;(b)longitudinal section

图5 A组神经横切面的扫描电镜观察(5000×)Fig.5 The cross-sections of nerve in group A(Field emission scanning electron microscope，5000×)

图6 B组神经横切面的扫描电镜观察(5000×)Fig.6 The cross-sections of nerve in group B(Field emission scanning electron microscope，5000×)

图7 C组神经横切面的扫描电镜观察(5000×)Fig.7 The cross-sections of nerve in group C.(Fieldemission scanning electron microscope，5000×)

2.5 断裂功耗

断裂功耗为样本从开始拉伸到断裂期间拉伸所做的所有功，从另一个角度反映了神经的强度。3组中，B组的断裂功耗最大，A组次之，C组最小，但3组间的差异无统计学意义(F=0.512，P=0.608)。3组的极限载荷、韧度、断裂功耗等见表1。

3 讨论

良好的组织工程神经支架材料要求:①具有良好的生物相容性和可降解性，能与周围组织融为一体，并支持神经再生及成熟;②材料本身应具备良好的生物力学性能(强度、弹性模量等);③提供种子细胞依附的框架，并作为种子细胞生长、发挥正常生物作用的有效载体;④具有足够的长度和直径;迄今为止，组织工程神经支架材料主要由人工合成材料和天然材料制成。人工合成支架材料包括不可吸收和可吸收的支架材料，不可吸收的人工合成支架材料的主要代表是硅胶管;可吸收的人工合成支架材料常用的有:聚羟基乙酸(Polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)、PGA/PLA共聚物等。天然支架材料主要包括生物膜、纤维蛋白、胶原、自体静脉、骨骼肌、水凝胶、自体神经、同种异体神经等。

表1 3组周围神经的生物力学特性±s，n=28)Tab.1 The biomechanical properties of peripheral nerve in group A、B、C(¯x ± s，n=28)

表1 3组周围神经的生物力学特性±s，n=28)Tab.1 The biomechanical properties of peripheral nerve in group A、B、C(¯x ± s，n=28)

分组 极限载荷/N 韧度/(N/mm)极限应力/MPa 极限应变 弹性模量/MPa 断裂功耗/10－3J A组 5.61±1.18 1.54±0.21 7.14±1.50 0.49±0.09 19.33±2.00 12.89±4.56 B组 6.44±0.98 2.29±0.41 8.20±1.25 0.44±0.10 26.70±5.22 13.01±4.14 C组 5.46±1.83 1.84±0.60 6.95±1.35 0.45±0.11 24.10±7.41 11.54±4.69

实验研究的脱细胞神经支架属于天然支架材料。已有研究证实:天然组织工程支架能为细胞提供近似体内的自然微环境［5-6］。并且经特殊处理消除其抗原性后，生物材料所保留的成分具有诱导组织再生的能力，移植后可诱导细胞及胶原沉积，促进移植物快速血管化［7］。脱细胞神经支架用于修复周围神经缺损已被实验证明是有效的［8－11］。

神经支架不仅为细胞提供附着场所、结构支撑的作用，其还必须具备与其修复的组织及周围力学环境相适应的生物力学性能(强度、弹性模量等)，以更好的适应新生的修复细胞和组织替代的过程。

本实验结果显示，与新鲜神经相比，两种方法处理后神经的生物力学特性经统计学检验基本无明显差异。而化学方法处理后的神经，一些生物力学特性有所下降，但这种下降经统计学检验并无统计学意义。可见单纯就生物力学特性而言，两种方法处理后的神经均适合在移植中应用。

周围神经最强健的结缔组织层是神经束膜，其次是神经外膜［12］。神经束膜、神经外膜细胞外基质(Extrac-ellular Matrix，ECM)组分的不同可能对脱细胞结构的生物力学性能有很大影响。化学萃取的过程也可能使ECM某一分子的数量减少，也就是说，脱细胞过程可能在一定程度上去除了一种或更多ECM组分，从而使得断裂前可吸收的能量减少［13］。而物理冻融组却不存在这种情况。可见，不同方法保留细胞外基质的效果不同，这就使得两种方法处理的神经呈现出不同的生物力学特性。

4 结论

实验发现以脱细胞神经基质作为一种神经组织工程支架材料，通过脱细胞处理降低其免疫原性，并保留细胞外基质，从脱细胞后神经基质的组织学和生物力学性质两方面进行实验研究，研究表明，与物理方法相比，化学方法能很好的去除雪旺细胞、轴突和髓鞘，并可以保证神经支架的生物力学特性。因此，经化学方法处理后的神经支架更适宜在移植中应用。

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