胰岛干细胞分离全程温度控制系统的研制

冯靖祎 胡 亮

（浙江大学医学院附属第一医院生物医学工程科，杭州 310003）

引言

糖尿病是一种严重威胁人类健康的常见病和多发病。糖尿病对人类健康危害最大的是在动脉硬化及微血管病变基础上产生的多种慢性并发症，糖尿病已被列为继心血管疾病及肿瘤之后人类的第三大疾病。在治疗方法上，药物与胰岛素治疗无法解决糖尿病相关并发症的问题；胰腺移植因手术创伤大、外科并发症多，治疗风险较大，并非糖尿病治疗的最佳方法；胰岛移植可以改善内分泌功能，对血糖代谢进行自我生理性调节，降低糖尿病并发症的发生率和提高患者的生活质量，它具有移植手术风险小，成功率高，并发症少，可重复移植，免疫抑制剂用量小，可达到胰腺移植相似的治疗效果，移植后可实时控制患者的血糖，因此胰岛移植是目前最理想的糖尿病治疗方法之一。

2000年，出现了使用2～4个胰腺进行分离，多次移植，使1型糖尿病患者完全摆脱胰岛素的方法［1］。目前成人胰岛细胞移植作为治疗糖尿病的一种新方法，已经展现出极其广阔的临床应用前景及巨大的社会与经济效益［2-3］。

从供体中分离出高活性和高数量的胰岛干细胞是成人胰岛干细胞移植成功的关键［4-5］。用于胰岛干细胞分离的复合胶原酶的活性和温度是密切相关的，一个好的胰岛干细胞分离过程的温度控制系统，可以提高胰岛干细胞分离的数量和质量，从而提高胰岛干细胞移植手术的成功率。

1 系统设计

系统的设计目的是通过对温度控制对象（胰岛分离消化罐）进行系统建模，采用PID控制方式，结合系统硬件与软件的设计，提高进行胰岛干细胞分离的消化罐的温度控制性能。

1.1 被控对象对温度的要求

胰岛干细胞分离过程首先要求在温度（4±0.5）℃的情况下，对供体胰腺灌注复合胶原酶溶液（HI Liberase，0.5g，350mL），使胰腺膨胀；然后，将胰腺剪切成5～6块，迅速升温到37℃（±0.3℃）进行机械震荡消化，消化完毕后温度再降到（4±0.5）℃，并加入稀释液终止消化；最后，利用COBE2991胰岛细胞分离机收集纯化的胰岛干细胞。复合胶原酶对胰腺的催化效率在4℃时基本不催化，在37℃时催化效率最佳。因此系统对温度控制精度的要求很高，温度控制过程有升温过程和降温过程，而且要求有一定的升降温速（10min内能够到达设定温度），系统升降温温度过冲小于0.5℃，恒温温度波动小于±0.3℃。

1.2 系统硬件设计

系统的结构框图如图1所示。

图1 系统结构框图Fig.1 System block diagram

由负温度系数热敏电阻温度传感器构成的检测电路将消化罐的温度转换成电信号，并经对数放大电路进行线性校正后，送入CPU芯片（STC12C5A60AD/S2）进行A/D转换；然后，该处理器把所测的温度值送LCD液晶屏显示，同时将其与键盘设定的温度值进行比较，并将差值经PID（proportion integration differentiation）控制器处理后，通过PWM脉宽调制器（pulse width modulation）控制功率输出电路，实现对热电冷却器（thermoelectric cooler，TEC）的精确控制，由此构成实时闭环负反馈温度控制系统。

1.2.1 温度检测与放大电路的设计

系统被控对象要求温度恒温稳定、变温迅速，这就对系统的温度测量提出了很高的要求。温度传感器采用10kΩ的负温度系数热敏电阻温度传感器。对于负温度系数的热敏电阻而言，其阻值与温度之间的关系可以表示为［6］：

式中，RT、R0是温度在T、T0时热敏电阻的阻值；B是热敏系数，T0=198.15K

由式（1）可知负温度系数热敏电阻器温度-电阻的变化是非线性的，采用对数放大电路对由负温度系数热敏电阻器构成的检测电路进行线性校正。系统的温度检测与放大电路如图2所示。

图2 温度检测与放大电路图Fig.2 Temperature detection and amplification circuit

1.2.2 功率输出控制电路

由单片机根据PID控制算法计算出控制量，输出占空比随控制量变化而变的方波工作电压，对加在热电冷却器变温元件两端的电压实行PWM脉宽调制控制，从而实现对系统的精确温度控制。系统通过采用H桥电路改变加在热电冷却器变温元件两端工作电压的极性，实现对系统的加热与制冷的切换，H桥电路如图3所示。

图3 H桥驱动控制电路图Fig.3 H-bridge drive control circuit

当系统需要加热时，CPU输出控制信号使Q1与Q4导通，Q2与Q3截止，TEC变温元件正向导通加热；当系统需要制冷时，CPU输出控制信号使Q2与Q3导通，Q1与Q4截止，TEC变温元件反向通电制冷。

1.2 系统软件控制策略

1.2.1 PID调节器的控制策略

PID控制器是一种比例、积分、微分并联负反馈控制器，其系统框图如图4所示。

图4 PID控制系统框图Fig.4 PID control system block diagram

PID控制系统输出的电压u（t）为

式中，Kp为比例系数，Ti为积分时间常数，Td为微分时间常数。

在离散时间控制系统中，PID控制系统用差分方程表示为

根据Ziegler-Nichle条件［7］，令

式中，Tk为临界震荡周期。代入式（4）得

这是一种简化的扩充临界比例整定法，又称归一参数整定法（由于其只需整定一个参数，因而适合计算机自整定）。该方法采用时间乘绝对误差积分（integral of time-weighted absolute error，ITAE）准则

式（6）的算法可变换为

实验中，N取值10，T为采样周期，由于在整个过程中T不变，所以计算最小值等效于求

由式（6）可以看出，当取最小值时，控制系统的状态为最佳。它具有对单位阶跃响应的初始误差考虑少，着重权衡瞬态响应后期出现的误差。应用这种准则设计的系统超调量小，抗干扰能力强，具有良好的选择性和灵敏度。

1.2.2 增量式PID控制算法

每次计算ITAE的值，并与上次得到的ITAEn-1的值进行比较，可以根据ITAE*的变化趋势对PID算法式中的参数进行修正，但是由于偏差的累加作用容易产生较大的累积偏差，使控制系统出现不良的超调现象［8］。增量式PID控制算法是通过前3次采样周期内的偏差信号e，en-1，en-2，即可计算出本次采样周期内的控制变量u的增量Δu的一种控制算法。

采用增量式PID控制算法，计算公式可以写为

1.2.3 PID控制系统参数自整定流程

PID控制系统参数自整定流程见图5。

图5 参数自整定流程Fig.5 Parameter self-tuning flow diagram

2 实验结果

对系统进行了模拟胰岛干细胞分离过程的温度测试，然后在我院胰岛实验室进行了小鼠的胰岛干细胞的分离试用。

2.1 系统温度控制性能测试

实验时采用200mL生理盐水代替胰腺与胶原酶混合物。系统温度测试的测温仪（Fluke51Ⅱ，美国）经浙江省计量科学研究院检测校准，系统温度测试如图6所示。

图6 系统温度测试图Fig.6 System temperature testing diagram

测温仪的温度传感器放置在消化罐内部中央，8块热电冷却器变温元件放置在消化罐的底部。通过外接蠕动泵使不锈钢消化罐内的液体温度均匀。开始测量前消化罐内的水温19.7℃，环境温度20.5℃。首先测试系统由环境温度降到4.0℃，降温速率与保持4.0℃恒温的效果，然后测试系统由4.0℃升到37.0℃，升温速率与保持37.0℃恒温的效果。测试结果如图7所示。由图7可知系统消化罐的温度由19.7℃降到4.0℃所需时间大约6min，由4.0℃升到37.0℃并恒定所需时间为7min，系统在升降温速率方面达到了既定的目标和要求。

图7 系统升降温示意Fig.7 Schematic diagram of heating and cooling system

系统在升温到37.0℃并恒定时的温度过冲和恒温效果如图8所示。由图8可知在系统加温到37℃并恒温控制时，温度过冲小于0.5℃，恒温波动小于0.3℃。

图8 系统37℃恒温效果示意Fig.8 Schematic diagram of the system results at keeping 37℃

2.2 系统使用前后实验小鼠的胰岛干细胞分离效果

图9 不同温度控制方法的胰岛分离结果。（a）水浴法；（b）半导体变温法Fig.9 Islet isolation results diagram by different temperature control.（a）water bathing method；（b）semiconductor temperature method

在本系统投入使用前，采用水浴法来控制胰腺的灌注与消化的温度，胰腺的灌注在底部放满冰的不锈钢盘子里进行，灌注时温度（6±3）℃，灌注时间为2min；胰腺的消化在DK-8D型电热恒温水槽内进行，消化温度（37±2.5）℃，消化时间为12min。系统投入使用后，胰腺的灌注在半导体变温温度控制系统的消化罐里进行，灌注时温度（4±0.5）℃，灌注时间为2min；胰腺的消化也在半导体变温温度控制系统的消化罐里进行，消化温度（37±0.5）℃，消化时间为12min。表1是在其它条件相同的情况下，不同的胰腺分离过程温度控制方式分离纯化后获得的胰岛得率和纯度。由表1可以看出在系统的投入运行后胰岛干细胞的数量和质量都有明显的提高。可见对胰岛分离过程温度的精确控制可以提高胰岛分离的数量和活性。

表1 分离胰岛得率纯度表Tab.1 Purity of isolated islet yield table

图9（a）是胰腺灌注与分离温度控制采用水浴法得到的消化完毕的胰腺分离结果；图9（b）是采用本半导体变温系统得到的消化完毕的胰腺分离结果。从中可以看出系统投入应用后，实验小鼠胰岛分离的数量有明显的提高。

3 结论与展望

本研究设计了一种利用热电冷却器的制热与制冷功能，对胰岛干细胞分离过程进行精确温度控制的系统。通过对系统的温度控制测试，系统变温温度过冲小于0.5℃，恒温温度波动小于±0.3℃。系统投入使用后，实验小鼠胰岛分离的数量和活性都有了提高。随着热电冷却器材料技术的不断发展，热电冷却器的变温性能会越来越高，同时基于单片机的温度控制技术也越来越成熟，热电冷却器变温技术将在更多领域得到广泛应用。

实验鼠胰岛干细胞的分离纯化是一个较复杂的技术，获得的胰岛干细胞的数量和质量受很多因素的影响［9-10］，温度只是胰岛分离过程的一个重要因素之一。此外，胰岛干细胞的分离纯化过程操作复杂，人为影响因素较多，导致分离结果个体间差异较大。今后，将对影响胰岛干细胞分离的因素进行更广泛的研究，希望找到对其具有影响的更多重要因素，以提高胰岛的分离数量和质量。同时，还将进一步研究人的胰岛干细胞分离技术，以便提高人的胰岛干细胞移植的成功率。

［1］Shapiro AM，Lakey JR，Ryan EA，et al.Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid free immunosuppressive regimen［J］.N Eng J Med，2000，343（4）：230-238.

［2］Couzin J.Diabetes Islet transplants face test of time［J］.Science，2004，306（5693）：34-37.

［3］Korsgren O，Nilsson B，Berme C，et al.Current status of clinical islet transplantation［J］.Transplantation，2005，79（10）：1289-1293.

［4］Lakey JRT.Current human islet isolation protocol［M］.Japan：Medical Review CO.Ltd，2004：80-81.

［5］Bertuzzi F，Secchi A，Di Carlo V.Islet transplantation in type diabetic patients［J］.Transplant Proc，2004，36：603-604.

［6］全红娟.热敏电阻温度传感器的非线性误差分析［J］.应用技术，2005，10：21-23.

［7］李晓帆，姚根和.高精度温度控制技术［J］.无线电技术，2005，33：67-77.

［8］历风满.数字PID控制算法的研究［J］.辽宁大学学报，2005，32（4）：367-370.

［9］Haan BJ，Faas MM，Spijker H，et al.Factors influencing isolation of functional pancreatic rat islets［J］.Pancreas，2004，29（1）：15-18.

［10］London NJ，Swift SM，Clayton HAet al.Isolation culture and functional evaluation of islets of Langerhans［J］.Diabetes Metab，1998，24（3）：200-204.