高效液相色谱法测定饲料添加剂中盐酸林可霉素的含量

程建国 宋艳红 王仲琴 徐 景 赵晶晶

盐酸林可霉素又称盐酸洁霉素，主要用于治疗革兰氏阳性菌和支原体感染。对葡萄球菌、溶血性链球菌作用较强，对厌氧菌如破伤风梭菌、产气荚膜芽孢杆菌有抑制作用，对猪痢疾密螺旋体和弓形虫也有一定作用。用作饲料添加剂时，可促进肉鸡和育肥猪的生长，提高饲料利用率。因此，盐酸林可霉素常被加在育肥猪和肉鸡饲料添加剂中，为了更好地控制饲料添加剂的质量，我们对高效液相色谱法测定饲料中盐酸林可霉素含量的方法进行了研究。

1 仪器与试药

WATERS2695高效液相色谱仪（包括四元泵，DAD 检测器，柱温箱，10 μl自动进样器）；KQ－100超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司生产）；Thermo sorvall型离心机；Sartorius BP210S型电子天平。

盐酸林可霉素对照品 (中国兽医药品监察所生产，批号：K0101003，含量 84.9%)，甲醇为色谱纯，其它试剂为分析纯。供试品为育肥猪饲料添加剂，添加量为5%。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精密称取盐酸林可霉素对照品0.05892 g(含盐酸林可霉素0.05002 g)，置100 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成每1 ml中含0.5002 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

称取供试品5.0 g 7份，分别置25 ml离心管中，精密称取对照品，①0.26 mg、②2.61 mg、③4.72 mg、④6.25 mg、⑤7.76 mg、⑥8.69 mg、⑦0 mg 分别添加入①～⑦号供试品中，编号一一对应，其中⑦号供试品作为空白样品，取上述供试品，分别精密加入甲醇15 ml，使供试品湿润，轻轻摇匀，超声20 min，5000转离心5 min，取上清液用0.45 μm滤膜过滤后，作为供试品溶液。

2.3 色谱条件

Inertsil ODS－3 色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相[1]：0.05 mol/l硼砂溶液： 甲醇（55： 45）；流速：1.0 ml/min；检测波长[2]：214 nm；柱温：25 ℃；进样量10 μl，出峰时间快，峰形比较好，按上述条件检测对照品溶液结果如图1，空白样品结果如图2，供试品溶液结果如图3。

图1 对照品结果

图2 空白样品结果

图3 供试品结果

2.3.1 色谱柱的理论塔板数

在2.3的条件下，注入对照品溶液，盐酸林可霉素保留时间为9.2min，林可霉素B峰保留时间为4.7min，盐酸林可霉素峰半峰高宽（Wh/2）为0.42 min，计算色谱柱的理论板数为2658。盐酸林可霉素和林可霉素B，两峰之间的分离度为5。

2.3.2 拖尾因子

将2.1项配制的对照品溶液按2.3条件测得林可霉素峰W0.05h为1.08 min，峰极大至峰前沿的距离d1为0.53 min，拖尾因子T为1.02，同样测得林可霉素B峰 W0.05h为 0.52 min，d1为 0.25 min，T 为 1.04，二者拖尾因子均在0.95～1.05。

2.4 线性关系考察

将对照品添加制成的①～⑥号溶液，按2.2色谱条件测定，结果见表1。以峰面积积分值为纵坐标，对照品质量为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为：y=1×106x+2030.6，R2=0.9987，表明林可霉素在 14.7～492 μg/ml范围内呈线性关系。

表1 线性范围考察结果

2.5 灵敏度

用2.2项配制的供试品溶液，按信噪比为3时测得盐酸林可霉素的检测限为0.15 μg，当信噪比为10时测得盐酸林可霉素的定量限为0.49 μg。

2.6 精密度

取2.2供试品④号（0.354 mg/ml）溶液，连续进样5次，峰面积结果分别为 492017、493356、492786、492394、494011，平均 680980,RSD=0.16%（n=5）。

2.7 稳定性试验

取2.1对照品溶液(0.5002 mg/ml)和2.2供试品④号溶液（0.354 mg/ml）按2.3条件进样检测，每隔一定时间进样一次，结果见表2。表明在5 h内，对照品和供试品溶液稳定性良好。

表2 稳定性试验结果

2.8 回收率试验

采用加样回收法，盐酸林可霉素在育肥猪饲料中的添加量为每千克饲料添加40～70 mg，试验所用供试品为5%添加的育肥猪饲料添加剂，这样盐酸林可霉素在添加剂中的含量为0.8～1.4 mg/g，试验中选取了0.8、1.1、1.4 mg/g三个添加浓度来测定回收率，每个浓度添加3份，结果见表3。

3 讨论

表3 回收率试验

对供试品的超声提取时间进行了考察，分别设定10、15、20、25、30 min，从检测结果来看，提取 20 min，检测结果稳定，回收率均在97%～100%，因此定为20 min。

4 结论

本研究所采用的检测方法，灵敏、可靠、检测结果稳定，可用于饲料添加剂中盐酸林可霉素含量的检测。

[1]陈明,耿志明,王冉,等.高效液相色谱法测定饲料中林可霉素的含量[J].江苏农业学报,2008,24(1):99-100.

[2]中华人民共和国农业部《中国兽药典》2005版第一册.