人脐血单个核细胞移植治疗血管性痴呆的临床研究

王昌铭，姚永杰，向 静，王景周，孙 鸣，吉国泰，苏长雨

近年来研究发现胚胎干细胞移植是治疗神经系统疾病最有希望的手段之一[1]，骨髓干细胞在体外培养可以分化为神经元和胶质细胞，治疗神经系统疾病取得了明显效果[2，3]。但涉及社会、伦理及法律等诸方面的问题。与骨髓相比，脐血干细胞来源丰富，易于采集、制备和保存；脐血的免疫系统还不成熟，处于一种缄默状态，T细胞也很幼弱，一般不会诱发免疫反应和移植物抗宿主反应。本试验笔者应用多份人脐血单个核细胞颈内动脉或静脉输注移植治疗血管性痴呆患者，旨在探讨人脐血单个核细胞经颈内动脉或手背浅静脉移植对血管性痴呆患者的认知功能、日常生活能力的治疗效果及安全性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2006-05～2009-12第三军医大学大坪医院野战外科研究所及洛阳市解放军150中心医院收治的血管性痴呆老年患者28例；男16例，女12例；年龄62～85.5岁，平均73.2岁；病程最短 5个月，最长 6年，平均23.9个月。CT、MRI检查：半球梗死、软化灶5例，基底核区软化灶6例，枕叶软化灶3例，小脑软化灶1例，多发腔隙性脑梗死4例，脑萎缩9例。病因确诊：脑出血9例，脑梗死19例；糖尿病史12例，合并糖尿病足3例；高血压病史19例；冠心病史8例。部位：前循环梗死6例，基底核区梗死8例，多发性脑梗死5例；基底核区出血6例，其中1例合并小脑出血，1例合并枕叶及脑室出血，单纯脑室出血3例。纳入标准：①根据临床表现和头部CT、MRI确诊，符合全国第四届神经精神学术会议制定的标准和美国精神病学会制定的《诊断和统计手册》[DSM-Ⅱ]标准，按Hachinski提出的缺血记分法10分以上者；②按2005年国务院《医院管理条例》第33条规定对患者的治疗及风险进行如实告知，患者对治疗均签署知情同意书，治疗方案经医院医学伦理委员会批准；③纳入患者均经过医院正规治疗4个月以上。足月新生儿脐血由第三军医大学大坪医院野战外科研究所提供，产妇及家属对脐血可能用于科学实验均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 人脐血单个核细胞的采集与分离 无菌条件下穿刺脐静脉，用肝素抗凝采血袋收集胎盘脐血，每份脐血50～100 ml，置保温盒中；并按照卫生部检测血液的标准检测每一份脐带血液。将血袋内抗凝脐血导入250 ml无菌生理盐水瓶中，0.01 mol/L无菌PBS液（pH7.4）等体积稀释，再与3%明胶1∶1混匀，静置40～60 min；吸上清2000 r/min离心5 min，弃上清，制成单细胞悬液，叠加到淋巴细胞分离液上，离心25 min，吸取中间白膜层；加入7～10倍体积PBS液，1000 r/min离心10 min，洗涤3次，弃上清，重悬于DMEM培养基中，置于25 cm2培养瓶中，加20%胎牛血清。经短期（12 h）培养后将细胞收集到离心管中，细胞洗涤后PBS洗涤3次后根据临床要求用0.9%的无菌生理盐水调整悬浮单个核细胞最终浓度为109/L。

1.2.2 细胞移植 患者入院确诊后，通过颈内动脉或手背浅静脉将脐血单个核细胞输注入脑卒中患者体内，每例患者平均输注6份，细胞数约1×108/份，每份间隔3～6 d，平均4 d。治疗期间未用其它促智药物和免疫抑制剂。

1.3 疗效评估标准 患者在细胞移植前和细胞移植后6个月，由专业康复医师进行评价。①脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分 （neural function deficiency，NFD）[4]：包括意识、水平凝视功能、面瘫、言语、上肢肌力、手肌力、下肢肌力、步行能力8个部分，总分0～45分，分数越低，神经功能状态越好；②采用简易智能量表（MMSE）评估认知功能：包括定向力、注意力、回忆力、计算力、语言能力及视空间能力，总积分0～30分，分数越高，认知功能越好；③日常生活能力量表（ADL）选用Barthel指数（BI）记分法评价日常生活活动能力[5]：包括进餐、洗澡、修饰、穿衣、平衡行走、上下楼梯等项目，总积分0～100分，分数越高，日常生活活动能力越高。

1.4 统计学处理 应用SPSS 13.0软件进行统计学处理，数据以±s表示，治疗前后各指标的比较采用配对t检验。

2 结 果

2.1 血管性痴呆患者细胞移植前后各种评分结果

与细胞移植前比较，移植后6个月患者神经功能缺损程度评分明显降低（t=-12.31，P<0.01）；简易智能量表评分和评价日常生活能力的Barthel指数均明显升高（t=17.82，t=21.02，P<0.01，表1）。

表1 细胞移植前后各量表评分（±s，n=28）

表1 细胞移植前后各量表评分（±s，n=28）

时间 NFD MMSE ADL移植前 24.89±6.36 14.18±3.12 30.57±8.95移植后 6 个月 12.50±2.61 24.04±4.41 67.50±12.64 t-12.31 17.82 21.02 P 0.000 0.000 0.000

2.2 不良事件和不良反应 整个治疗过程中未使用免疫抑制剂，在细胞移植过程中及移植后均未发生并发症及不良反应。

3 讨 论

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由一系列脑血管因素引起脑组织梗塞、低灌注或出血所致的学习、认知和记忆障碍综合征，是严重影响中老人健康的常见病、多发病，发病率逐年上升，至今尚无特效的治疗方法。

本文试验采用自身前后对照研究，观察脐血单个核细胞移植治疗对血管性痴呆患者的神经功能恢复、认知功能和日常生活活动等能力的影响；结果显示移植前后的简易智能量表、ADL的评分提高，NFD评分下降明显，说明脐血单个核细胞能有助于神经功能的恢复，有效改善血管性痴呆患者认知功能和日常生活能力，延缓和阻止病情发展，从而提高了生活质量。结果显示起效时间长短不一，大部分在移植结束1个月后记忆力逐渐改善，不仅表现在近期记忆力，还能显著恢复患者远期记忆力；有的患者其定向力、计算力、逻辑推理等能力均显著提高，甚至恢复到患病以前水平，具体表现在棋牌类等游戏方面；同时还观察到明显提高患者的视力、听力、瘫痪肢体肌力和吞咽功能，恢复其站立、运动行走、平衡能力、进餐，改善睡眠、语言障碍，提高及恢复患者的认知功能及情感反应等，还可改善糖尿病足水肿、坏疽和冠脉缺血程度，以及衰老皮肤光泽、溃疡恢复，白发变黑等。在随访中有6例患者移植后6个月病情改善速度减慢，甚至病情反复，痴呆症状在好转基础上出现退步；22例症状在1年内未出现反复和退步，其中有9例在首次疗程结束6个月后再次进行脐血单个核细胞输注，发现患者病情在原来好转基础上又进一步改善，6例1年后进行第3次治疗，随访至今未出现病情反复和退步现象；同时还观察到4例病程4～6个月患者，其神经功能的改善较病程长者显著提高。分析可能与首次输注干细胞数量不足、进入病变局部干细胞数量有限、干细胞在机体内存活有一定时限或被机体免疫细胞杀灭等不定因素有关；而少量、多份叠加、多阶段性输注脐血单个核细胞有利于补充体内干细胞数量，使机体病变组织细胞得以持续不断的改善和修复；而且血管性痴呆患者干细胞早期干预对病情恢复有积极的深远意义。分析本次临床试验研究，移植脐血单个核细胞改善神经功能的机制之一可能与细胞纵向分化有关，即脐血单个核细胞能够分化为神经干细胞，脐血尽管来源于中胚层，而神经干细胞来源于外胚层，但3个胚层的区分是人为的，各个胚层之间存在着相互联系，脐血中也含有来源于外胚层的神经干细胞；是否存在“中胚层细胞横向分化”机制，目前尚不十分清楚。笔者所在课题组基础和/或动物实验结果已证实脐血中含有未成熟干/祖细胞如CD133+细胞，能够分化为神经元和神经胶质细胞，同时移植脐血单个核细胞/间充质干细胞能够透过BBB在损伤脑组织中存活、迁移、分化为新生神经元，抑制或取代坏死和凋亡神经细胞，与宿主的神经细胞在形态结构和功能上形成整合，参与正常神经环路，建立有生物功能的突触联系，促进脑卒中后轴突重塑而改善神经功能的缺损[6－9]，并上调 BDNF 和 NGF 的表达[10，11]和Ach含量及AchE活性明显升高[12]，激发内源性修复系统，减轻缺血后脑组织再损伤；另外，研究也表明脐血干细胞透过BBB与时间窗呈显著正相关[13]。临床研究表明，血管性痴呆患者神经功能的改善可能是由脐血单个核细胞分化为神经细胞与宿主脑组织整合并参与神经环路的重建，或者因含有大量的造血集落形成细胞、血小板生成素和白细胞介素11和造血因子集落刺激因子1，能促进脑卒中损伤的局部神经祖细胞增殖、分化，抑制细胞凋亡，降低神经损伤，促进功能恢复[14]。而这些细胞分泌的营养因子也起一定的作用[15]，在梗死后应用外源性神经营养因子能限制急性神经缺血损伤的扩展及有助于功能的恢复[16]。另外还与干细胞明显改善胆碱能系统的功能，调节脑内Ach生理代谢有关，进而增强了学习记忆能力。研究又进一步发现痴呆患者越早干预，其神经功能的改善越明显，可能由于脑损伤病程越短，BBB透过性越高，更有利于干细胞顺利进人脑实质，从而提高进入局部病变的细胞数量[13]。研究已证实成体中枢内还存在尚未激活的、有分化潜能的干细胞，通常处于“静止”状态，只有在特定条件下才能被激活，重新进入细胞增殖周期，并进一步分化为特定功能的神经细胞[17]。因此，脐血单个核细胞通过自身合成与分泌功能使静止的神经干细胞激活并促进神经组织的自我修复，改善神经功能。

笔者所在课题组研究表明，脐血间充质干细胞在适当的条件下经扩增培养后可获得细胞克隆球，表达 nestin，并可向神经样细胞诱导分化[7，18]；将其移植治疗CNS疾病（如脑卒中、外伤及脑、脊髓变性疾病）也取得了一定的效果[19]。通过动脉或静脉输注脐血干细胞，能够透过血脑屏障进入血管性痴呆大鼠脑组织存活，迁移至受损部位，分化为新生神经细胞，保护损伤神经元和胶质细胞，减少细胞凋亡，缩小脑缺血范围，显著改善神经功能缺失和学习记忆能力，明显减轻老年痴呆的症状[8]。研究也证实人脐血内皮祖细胞参与血管重建，促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用，且无致瘤性[20]。

本组患者应用多份、多次脐血单个核细胞动脉或静脉输注，随访至今均未发生并发症和不良反应，并且临床疗效明显，表明脐血干细胞存在“免疫逃逸”和“局部专一诱导性分化”现象。脐血单个核细胞动脉或静脉移植治疗血管性痴呆，因其取材方便，来源丰富，易于采集、制备及保存，无病毒、细菌及肿瘤细胞污染，且淋巴细胞不成熟，NK活性低，免疫原性弱，不需要人类白细胞抗原配型，极少出现免疫排斥反应，更重要的输注途径方法简便、安全有效，短期内可明显改善血管性痴呆患者的神经功能、认知功能和日常生活能力，提高了生活质量，故是对血管性痴呆患者机体缺血性病变整体治疗的一种有效治疗手段，在此基础治疗前提下，若早期干预，并配合局部干细胞移植效果或许更佳。

[1]Jeong JA,Gang EJ,Hong SH,et al.Rapid neural differentiation of human cord blood-derived mesenchymal stem cells[J].Neuroreport,2004,15(11):1731-4.

[2]Jang YK,Park JJ,Lee MC,el at.Retinoic acid-mediated induction of neurons and glial cells from human umbilical cordderived hematopoietic stem cells[J].Journal of Neuroscience Research,2004,75(5):573-84.

[3]Ha Y,Lee J,Kim K,et al.Intermediate filamentnestin expressions in human cord blood monocytes(HCMNCs)[J].Acta Neurochir,2003,145:483-7.

[4]Chen QT.Clinical neurological defect scoring for stroke patients.Zhonghua Shenjingke Zazhi,1996,29(6):381-383.

[5]唐佩弦.我国造血干细胞基础研究的新进展兼论干细胞可塑性[J].中国实验血液学杂志，2003，11（1）：1-5.

[6]Man Y,Li JB,Yang B,et al.Vein transplantation using human umbilical cord blood stem cells in the treatment of stroke sequela.Neural Regen Res,2006,1(7)：618-621.

[7]周 毅，王景周，王昌铭，等.人脐血单个核细胞中Nestin阳性细胞表达及其临床意义.第三军医大学学报，2005，27（08）：773-775.

[8]王昌铭，姚永杰，向 静，等.人脐血单个核细胞颈内动脉输注对血管性痴呆大鼠学习记忆的作用及在脑内迁移分化.中国行为医学科学，2007，16（6）：493-496.

[9]Garbuzova-Davis S,Willing AE,Zigova T,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood cells in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis:distribution,migration and differentiation[J].J Hematother Stem Cell Res,2003,12(3):255-70.

[10]Fan CG,Zhang QJ,Tang FW.Human umbilical cord blood cells express neurotrophic factors[J].Neuroscience Letters,2005,380(3):322-325.

[11]王昌铭，向 静，王景周，等.脐血单个核细胞对血管性痴呆大鼠脑组织 BDNF、NGF 的影响.中华神经医学杂志，2008，7（4）：367-369.

[12]向 静，王昌铭，江德鹏，等.脐血干细胞海马移植对VD大鼠脑内Ach及AchE活性的影响.中国神经精神疾病杂志，2007，24（07）：389-394.

[13]王昌铭，向 静，王景周，等.血管性痴呆大鼠颈内动脉输注脐血单个核细胞与血脑屏障的相关研究.第三军医大学学报，2006，28（12）：1231-1333.

[14]Willing AE,Lixian J,Milliken M,et al.Intravenous versus intrastriatal cord blood administration in a rodent model of stroke.J Neurosci Res,2003,73(3):296-307.

[15]Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats.Stroke,2001,32(11):2682-2688.

[16]Ay I,Sugimori H,Finklestein SP.Intravenous basic fibroblast growth factor(bFGF)decreases DNA fragmentation and prevents downregulation of Bcl-2 expression in the ischemic brain following middle cerebral artery occlusion in rats.Brain Res Mol Brain Res,2001,87(1):71-80.

[17]Seaberg RM,van der Kooy D.Adult rodent neurogenic regions:the ventricular subependyma contains neural stem cells,but the dentate gyrus contains restricted progenitors.J Neurosci,2002,22(5):1784-1793.

[18]Colin PM,Nicolas F,Quentin A,el at.Umbilical cord blood stem cells can expand hematopoietic and neuroglial progenitors in vitro[J].Experimental Cell Research,2004,295(Pt 2):350-9.

[19]Vendrame M,Cassady J,Newcomb J,et al.Infusion of human umbilical cord blood cells in a rat model of stroke dosedependently rescues behavioral deficits and reduces infarct volume[J].Stroke,2004,35(10):2390-5.

[20]谢松涛，陈 璧，陶 克.人脐血内皮祖细胞体内促进血管重建的实验研究[J].中国美容医学，2007，16（1）:15-18.