黄芩内生细菌的分离及抑菌研究

郭 纯，许召贤，吕晶森，周小江

（湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

内生菌（Plant endophyte）是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的微生物，这些微生物有细菌、真菌、放线菌等[1-3]。植物内生菌侵入寄主植物后，在特定的环境和生理条件下，不仅能胁迫促进寄主体内次生代谢产物的形成和累积，而且自身也可产生与宿主相同或不同的生理活性物质。因此，从植物内生菌入手来研究道地药材的形成具有深远的意义[4-10]。

黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）为常用的著名的传统中药之一，是唇形科植物黄芩的干燥根，具有抗菌，消炎及抗病毒的功效[11]。目前国内外关于黄芩的研究主要集中在植物化学成分和栽培等方面，而内生菌的研究较少且集中在内生真菌，其内生细菌研究尚未见报道[12]。为此，笔者对黄芩内生细菌进行了分离，并研究了其发酵液抗菌的效果，旨在探索黄芩与其内生细菌的关系以及进一步寻找新的抗菌活性成分。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 子芩采自安徽亳州，经鉴定为黄芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的根。

1.1.2 供试菌种 供试指示菌菌种为大肠杆菌（Escherichia coli），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），金黄色葡萄球菌（Staphylocccus aureus），均购自广东省微生物研究所。

1.1.3 培养基 NA（牛肉膏蛋白胨培养基）：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，pH值7.2。固体培养基另加2%的琼脂粉。

1.2 方法

1.2.1 黄芩内生细菌的分离纯化 （1）表面消毒：参考宋培勇等介绍的方法，稍做改进。将黄芩根用蒸馏水冲洗，风干表面水分，剪成小段，无菌水漂洗2次，75%酒精浸泡1min，再用0.1%氯化汞溶液浸泡10 min，转入75%酒精中浸泡30 s，接着用无菌水漂洗3次，平放于 NA平板上，28℃培养 2～3 d。取最后一次漂洗液涂布NA平板作为对照。（2）内生菌分离和纯化：将NA平板上组织块下或周缘长出的菌落或菌苔划线稀释分离 1～2次直到获得纯培养。

1.2.2 黄芩内生细菌的形态学鉴定 从菌落特征、革兰氏染色特征、细胞形态特征等对分离菌株进行初步鉴定。

1.2.3 黄芩内生细菌的发酵 将纯化后的单个菌落转接到装有30mL NA液体培养基的100mL锥形瓶中，在30℃，160 r/min条件下振荡培养，作为种子培养液。2 d后，移取1mL的种子培养液接种到装有100mL PDA液体培养基的250mL锥形瓶中，30℃，160 r/min条件下进行发酵培养3 d。

1.2.4 发酵液抑菌活性测定 将高温灭菌后的滤纸片（R=8 mm）在离心得到的发酵液中浸泡，取出晾干，然后再浸泡1次，取出晾干，以加大滤纸片上有效物质的浓度。将晾干的滤纸片放在涂有指示菌的培养基上，并且以无菌水和0.01 mg/mL的氨苄青霉素做对照。生化培养箱中30℃培养2 d，观察抑菌圈的有无以及测量抑菌圈的直径（抑菌圈直径=无菌圈直径-滤纸片直径）[10]。

2 结果与分析

2.1 黄芩内生细菌的分离

通过微生物学传统分离培养和划线稀释分离方法从子芩中获得内生细菌8株。其中既有革兰氏阴性菌株，又有革兰氏阳性；既有杆状的，也有短杆状或球状的（表1）。

表1 黄芩8种内生菌平板培养的形态学观察结果

2.2 黄芩内生细菌发酵液的抑菌性

8种黄芩内生菌液体发酵后，对其进行了抑菌活性测定。结果如表2所示，7种菌的发酵液对大肠杆菌生长均有抑制作用，6种对枯草芽孢杆菌生长有抑制作用，5株对金黄色葡萄球菌生长有抑制作用。其中G8菌株发酵液对大肠杆菌抑制作用效果最好，G6菌株发酵液对枯草芽孢杆菌抑制作用效果最好。

3 结论与讨论

植物内生菌还是一个未开发的新领域，它们所产生的抗菌物质往往是新颖的，可能具有很好的应用特性。研究表明，黄芩根中存在一定数量的内生菌，其内生菌对病原菌有抑菌活性。因此，利用黄芩内生菌筛选高效、新颖、低毒的抗菌活性物质存在很大的可能性。

表2 黄芩8种内生细菌发酵液抑菌效果

试验通过微生物学传统分离培养和划线稀释分离方法从黄芩根中分离出内生细菌8株。以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为供试菌，对8种黄芩内生菌液体发酵并进行了抑菌活性测定，结果表明，黄芩内生细菌对3种供试菌有一定的抑菌活性。

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