吴茱萸碱调控微管蛋白聚集阻滞HepG－2细胞周期

高世勇，刘 溪，季宇彬

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076;2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076)

《本经》、《本草纲目》等中药专著中记载，吴茱萸主温中下气，止痛，咳逆寒热，除湿，血痹，逐风邪，开腠理，治吞酸，厥阴痰涎头痛，阴毒腹痛，疝气血痢［1］.吴茱萸碱是色胺吲哚类生物碱，是吴茱萸主要的生物碱类化合物，其分子式为C19H17N3O，分子质量为303.36，结构式如图1.吴茱萸碱的药理作用在近些年越来越受到关注.国内外研究表明吴茱萸碱对于心脏［2－3］、内分泌系统［4－5］、支气管平滑肌［6］及胃肠道［7］等均具有较强药理作用，并且具有抗炎镇痛［8］、减肥的作用［9］，还能够增强机体免疫力［10－11］等.体内、体外抗肿瘤实验可知，吴茱萸碱对 HeLa人宫颈癌［12］、A375－S2人黑色素瘤［13－14］、MCF7 人乳腺癌［15］、NCI/ADR－RES 人耐药乳腺癌［16］等多种肿瘤细胞株均有细胞毒作用;而吴茱萸碱对人肝癌HepG-2细胞作用的报道很少，其对HepG-2细胞周期影响及机制的研究未见报道.本实验研究吴茱萸碱对HepG-2细胞周期的阻滞作用，并且确定其对HepG-2细胞内微管蛋白聚集形态的影响.

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株

人肝癌HepG-2细胞是由黑龙江省肿瘤医院肿瘤药物研究所提供.

1.1.2 实验试剂

吴茱萸碱(Evodiamine)药物纯度大于98%、胰蛋白酶、碘化丙锭 (PI)、二甲基亚砜(DMSO)购自于Sigma药物公司;羟基喜树碱(HCPT)购自于上海龙翔生物医药公司;RPMI1640培养基购自于GIBCO公司;Tubulin抗体、FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)购自于碧云天生物技术研究所;胎牛血清购自于杭州四季青生物工程公司;MTT粉末(噻唑蓝)购自于Molecular Probe公司.

1.2 仪器设备

二氧化碳细胞培养箱(CO-150型)购自于美国NBS公司;超净工作台(DL-CJ-1N医用型)购自于北京东联哈尔仪器制造有限公司;全自动酶标仪(680型)购自于美国Bio-Rad公司;流式细胞仪(EPICS–XL型)购自于美国Beckman Coulter公司;激光共聚焦显微镜(SP2型)购自于德国Leica公司;微量振荡仪(TL-2000MMⅢ型)购自于姜堰市天力医疗器械公司;荧光倒置显微镜(CKX-41-32型)购自于日本OLYMPUS公司.

2 实验方法

2.1 细胞培养

将人肝癌HepG-2细胞以适当浓度接种在细胞培养瓶内，用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，于温度为恒37℃、CO2为5%的细胞培养箱中孵育，每2 至3 d传代［17］.

2.2 采用MTT法检测吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG-2的增殖抑制作用

取对数生长期的HepG-2细胞，经胰酶消化后，加入培养液制成细胞悬液，将细胞浓度调整为2 ×104个/mL，接种于 96 孔板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO2的二氧化碳培养箱中培养24 h，加入不同浓度的吴茱萸碱，每孔100μL，每个剂量设置6个平行孔;阴性对照组加入同等体积的RPMI1640，阳性对照组加入羟基喜树碱，置于二氧化碳培养箱中继续培养72 h后，吸去上清，加入浓度为0.5mg/mLMTT溶液，每孔加入100μL，继续在培养箱中培养4 h后，弃去上清，每孔加入150μL DMSO，微量振荡器振荡5min，充分混匀后，酶标仪以检测波长570 nm条件下测定吸光度 (OD值).根据所测吸光度值计算抑制率以及IC50.

抑制率 =(对照组OD值-给药组 OD值 )/对照组OD值×100%

2.3 流式细胞术检测吴茱萸碱对HepG-2细胞周期的作用

以细胞浓度为2×105个/mL的人肝癌细胞HepG-2铺于六孔板中，孵育24 h后，以三种不同浓度的吴茱萸碱继续孵育24 h后，收集细胞，以2000 r/min、10min离心，弃去上清，用70%的冰乙醇，在4℃环境下固定过夜，经PI染液(PI 2.5mg，Rnase 0.5mg 及 Trtiton-X-1000.25mL)800μL，避光染色30min后，过500目尼龙网过滤，流式细胞仪(FCM)进行检测，激发波长为488 nm.

2.4 免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜检测吴茱萸碱对HepG-2细胞微管蛋白的影响

取对数生长期的人肝癌HepG-2细胞，经胰酶消化，加入3mL含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基，吹打成细胞悬液，调整悬液浓度为1×105个/mL，将其接种于放有已灭菌盖玻片的六孔板中培养24 h，分别加入终浓度为 10、20、40μmol/L 的吴茱萸碱，并同时设计阴性对照组及阳性对照羟基喜树碱组，在培养箱中孵育24 h.PBS缓冲液洗2次，每次1min.4%多聚甲醛固定细胞40min，PBS缓冲液洗2次，每次1min.加入0.1%TritonX-100，在室温下孵育30min后，PBS缓冲液洗1次.每孔加入BSA室温封闭2 h后，PBS洗3次，每次1min，滤纸吸干多余PBS.加入微管蛋白抗体(1∶500稀释)，4℃条件下湿盒中孵育过夜.加入PBS洗3次，每次1min.继续加入FITC标记的山羊抗小鼠IgG(1∶500稀释)，湿盒中室温孵育2 h，PBS缓冲液洗3次.采用无荧光甘油(甘油∶PBS=9∶1)封片，在激光共聚焦显微镜CLSM下观察、拍照，检测条件为吸收波长490～495 nm，激发波长520～530 nm.

2.5 实验数据统计学处理

3 实验结果

3.1 吴茱萸碱对人肝癌HepG-2细胞的细胞毒作用

吴茱萸碱对人肝癌 HepG-2细胞的 IC50为19.62μmol/L，如表 1.

表1 吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG-2增殖的影响

3.2 流式细胞仪分析吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG-2细胞周期的阻滞作用

经流式细胞仪检测分析表明，吴茱萸碱以2.5、5、10μmol/L 作用 HepG-2 人肝癌细胞 24 h后，G2/M期比例分别为 18.591%、22.613%及24.424%，如表2.结果表明，吴茱萸碱可将HepG-2细胞周期阻滞于G2/M期.

表2 流式细胞仪测得吴茱萸碱对HepG-2细胞G2/M期分布的变化

3.3 免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜观察吴茱萸碱对人肝癌细胞HepG-2微管蛋白的影响

如图1，可见阴性对照组的人肝癌HepG-2细胞的微管蛋白呈网络状，微管蛋白纤维为清晰的丝状，并且由细胞中心、沿着细胞长轴向四周辐射分布.经吴茱萸碱的给药组则可见微管蛋白分布形态紊乱，由长条型变为不规则型、圆形;随着给药剂量的增加，微管蛋白排列方式由原有的辐射状变为呈束状分布，向细胞的一侧聚合，呈斑块状亮绿色.表明吴茱萸碱可使细胞微管蛋白的聚合态发生改变.

图1 HepG-2细胞内微管蛋白免疫荧光染色

4 讨论

通过流式细胞仪检测分析可知吴茱萸碱将人肝癌HepG-2细胞的细胞周期阻滞于G2/M期，各终浓度给药组与阴性对照组相比G2/M期所占百分比均显著提高.在G2/M期时细胞进行有丝分裂，而在细胞有丝分裂过程中微管起着关键性作用，由此，进一步通过免疫荧光技术，经抗体特异性标记HepG-2细胞内微管蛋白α-tubulin，激光共聚焦显微镜观察微管蛋白的聚合状态，发现微管蛋白由清晰丝状网络态变为束状分布.实验表明，吴茱萸碱能够发挥其显著的抗肿瘤作用，是通过影响微管蛋白的聚合形态(即以微管为靶点)，即微管蛋白由辐射状变为束状聚合，进而干扰纺锤体的形成，阻断肿瘤细胞HepG-2的有丝分裂进程，诱导其细胞周期阻滞于G2/M期.而吴茱萸碱对微管的作用机制将会被在进一步的实验中得到证实，比如吴茱萸碱对有丝分裂促进因子MPF及微管蛋白相关蛋白MAP的调控.

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