莱菔硫烷诱导人肝癌HepG－2细胞凋亡的JNK途径

邹 翔，曲中原，白 晶，季宇彬，

(1.哈尔滨商业大学 生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨 150076;2.国家教育部 抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨 150076;3.哈尔滨商业大学中药学博士后流动站，哈尔滨 150076)

西兰花(Broccoli)卓越的防癌抗癌作用归因于其富含异硫氰酸盐类物质，而莱菔硫烷(sulforaphane，SFN)是其中最主要的活性成分之一［1－5］.以往研究表明，SFN可通过完全抑制I相酶，并且诱导II相解毒酶的表达而预防化学物诱发的肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、直肠癌等多种癌症的发生［6－7］.近年来研究发现，SFN 可通过诱导 HepG－2细胞发生G2/M期阻滞，并通过启动线粒体途径诱导人肝癌HepG－2细胞凋亡，发挥抗肝癌作用［8－9］.本文主要在考察 SFN 诱导 HepG－2细胞凋亡作用的基础上，研究SFN对人肝癌HepG－2细胞中JNK和p－JNK蛋白表达的影响，探讨JNK信号转导途径在SFN诱导HepG－2细胞凋亡中的作用.

1 材料与方法

1.1 细胞

人肝癌HepG－2细胞株，由哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研工作站传代保种.

1.2 药品和试剂

莱菔硫烷(分子式C6H11NOS2，相对分子质量为 177.3，纯度98.3%)，美国 Alexis公司，用前以二甲基亚砜(DMSO)溶解，－20℃保存，临用时加培养液稀释至所需浓度，使DMSO终质量分数不超过0.1%;阿霉素(批号080907)，浙江海正药业股份有限公司;RPMI－1640培养基干粉，美国GIBCO公司;胰蛋白酶、二甲基亚砜(DMSO)，美国Sigma公司;Hoechst 33258:Sigma公司;鼠抗JNK/SAPK抗体、鼠抗p－JNK/SAPK抗体、碱磷酶标记马抗鼠IgG，碧云天公司;其他试剂均为国产分析纯.

1.3 实验仪器

CO2培养箱，日本Sanyo公司;低温高速离心机，美国Beckman－Coulter公司;荧光显微镜:日本Olympus公司;水平电泳仪、电转仪，美国Bio－Rad公司;超净工作台，苏净集团.

1.4 细胞培养

人肝癌细胞系HepG－2常规细胞复苏后，培养于含有10%胎牛血清RPMI－1640培养液中，置于CO2培养箱(37℃，体积分数为5%的CO2，相对湿度95%)培养.2～3 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验.

1.5 荧光显微镜观察凋亡细胞形态

先将6孔培养板内放上盖玻片，取对数生长期细胞接种于6孔培养板中，细胞浓度为3×105个/mL，置培养箱中37℃、5%CO2培养24 h后加入不同浓度的SFN(使其终浓度分别10、20、40μmol/L)，阳性对照组加 ADR(终浓度 0.5μmol/L);阴性对照组加相同体积的培养液.48 h后细胞用胰酶消化，加PBS洗1次，加入固定液(甲醇和冰醋酸的体积比为3∶1)，4℃固定10min后，加入质量浓度为5mg/L的荧光探针Hoechst 33258，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育15min，将孔中的盖玻片取出，盖在已滴好甘油的载玻片上，置于荧光倒置显微镜上观察细胞形态并照相.

1.6 Western blotting法检测细胞内 JNK和 p－JNK蛋白的表达

将对数生长期细胞用胰酶消化后，传代培养于细胞培养瓶，24 h贴壁后给药.各给药组设计为:给药组(SFN 终浓度 10、20、40μmol/L)、对照组(加等体积 RPMI 1640)、阿霉素组(终浓度0.5μmol/L).48 h后，收集细胞，用预冷的 PBS洗2次、离心，加入裂解液冰上裂解1.5 h，4℃、12000 r/min离心10min提取总蛋白.570 nm处测定吸光度，计算蛋白含量，并用细胞裂解液将各样品调至相同浓度.配制5%的浓缩胶及12%的分离胶进行 SDS－PAGE电泳.电泳条件:浓缩胶80 V，待样品前沿进入分离胶后调电压至100V.转膜条件:200 mA恒流转膜60min.将凝胶中的蛋白转移到NC膜上，5% 脱脂奶粉封闭2 h，加一抗过夜.次日，取出NC膜用TBST缓冲液充分振摇洗膜3次，每次10min.加碱磷酶标记马抗小鼠IgG室温孵育2 h后，TBST振摇洗膜3次，每次10min.加显色液显色，Tannon凝胶成像系统照相.扫描图像在天能GIS凝胶成像分析系统进行量化分析.

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 SFN对HepG－2细胞凋亡的影响

实验结果如图1所示.不同浓度SFN作用于HepG－2细胞48 h后，荧光显微镜下可见随着药物浓度的增大，凋亡细胞数量逐渐增多，细胞出现核染色质固缩浓集，同时伴有凋亡小体的形成.而空白对照组细胞胞核呈均匀蓝色，无深染的亮点，表明染色质均呈均匀分布.

图1 荧光显微镜观察SFN对HepG－2细胞凋亡的影响

2.2 SFN对人肝癌HepG－2细胞内JNK和p－JNK蛋白表达的影响

实验结果如图2－5所示.结果表明，随着SFN浓度的增加，HepG－2细胞内JNK蛋白表达并无明显变化，而p－JNK蛋白表达逐渐增加，各组与对照组比较，差异均具有统计学意义(P＜0.05或P ＜0.01).

3 讨论

近年来，国内外对于SFN防癌抗癌的作用及机制进行了较为深入研究，已成为热点研究问题.本论文前期研究发现，SFN可通过诱导人肝癌HepG－2细胞发生G2/M期阻滞和凋亡发挥抗肝癌作用，其机制可能是:1)SFN可通过下调HepG－2细胞内Cdk1和CyclinB1蛋白的表达、上调p－Cdk1的表达抑制Cdk1－CyclinB1复合物的形成和活化而将HepG－2细胞阻滞于G2/M期;2)SFN可下调Bcl－2基因表达、上调Bax基因表达，进而诱导线粒体通透性转变孔道(PT孔道)的开放，促进线粒体内Cyt－c向胞浆的释放;释放的Cyt－c进一步与 Apaf－1、procaspase－9结合形成凋亡体，活化的 caspase－9进一步激活下游的caspase－3，最终完成 SFN通过线粒体途径诱导HepG－2 细胞的凋亡过程［7－9］.而本课题采用荧光显微镜也证实，SFN可诱导HepG－2细胞发生凋亡，并呈现一定的剂量依赖性.

对于MAPK信号转导通路而言，在大多数情况下，JNK信号传导途径在细胞应激反应中的作用具有复杂性、多样性的特点，被激活后可促进细胞凋亡的发生，具体机制与诱导FasL和TNFR1的表达、调控凋亡相关基因的差异表达及激活Caspase家族有关.有研究表明，鱼藤酮诱导的SH－SY5Y细胞凋亡中，JNK的磷酸化状态被大大加强，并且是Caspase依赖性的，说明鱼藤酮诱导SH－SY5Y细胞凋亡，是通过激活JNK通路，进而通过Capase家族起作用的.在Fas介导的细胞凋亡中，JNK起到了重要作用.在 Fas激活 Caspase后，活化的Caspase裂解JNK的上游调控分子MEKK1，进而激活 JNK 通路诱导凋亡［10－11］.而本研究发现，SFN可上调p－JNK蛋白的表达进而激活JNK信号通路，这可能是其诱导HepG－2细胞凋亡的主要机制之一，但结合已有研究我们发现，除了线粒体通路外，死亡受体通路可能也参与了SFN诱导HepG－2细胞凋亡的过程，但该方面的研究还有待进一步证实.

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