大庆盐碱土中微生物的分离及芽孢杆菌的鉴定

张飞鹏，林志伟，张振南，靳学慧

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319）

土壤是微生物生存的良好环境，土壤中有多种类群的微生物，它们对自然界物质的转化和循环起着极为重要的作用，对农业生产和环境保护有着不可忽视的影响[1]。微生物的分离纯化是研究土壤微生物的主要方法之一，对土壤中微生物群体结构分析能反映出土壤生物活性和土壤肥力状况[2]。在盐碱土中，因可溶性盐类含量高而提高了土壤交换物质的饱和度，从而对作物产生有害影响[3]。大庆地区盐渍化土壤属于苏达盐碱化土壤，其特点是pH值在8以上，NaHCO3含量也很高，毒性大，抑制了该区农业生产的发展[4]。芽孢杆菌属（Bacillus）细菌对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性，能在极端条件下生存[5]，可用于土壤修复、防治植物病害、降解土壤中难溶的含磷、含钾化合物等，有着十分广泛的应用价值[6]。以大庆盐碱土壤为材料，分离统计土壤中各类微生物菌落，初步了解本地区土壤微生物的构成情况，为有效利用本地适生有益微生物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验土壤

供试土壤取自黑龙江八一农垦大学校区外周草地的盐碱土。分别在4个方向选取3点，每点按1 m×1 m取样，每点取土深度15 cm，将样点土壤混均后取200 g装入无菌三角瓶中，带回实验室备用。

1.2 供试培养基

牛肉膏蛋白胨培养基，高氏1号培养基，马丁氏培养基，糖发酵试验培养基，V.P.培养基，明胶液化培养基，淀粉水解培养基，苯丙氨酸培养基，硝酸盐液体培养基，产吲哚培养基，柠檬酸盐培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤微生物的分离与计数

利用平板稀释法分离土样中细菌、放线菌和霉菌[7]。将 1 g 土样用无菌水配制 10-3、10-4、10-5稀释度的悬浊液，分别在无菌条件下涂布于牛肉膏蛋白胨、高氏1号和马丁培养基制成的平板上，然后置于适宜温度下培养。在30～37℃条件下培养1～2 d后对细菌菌落进行计数；在28℃条件下培养5～7 d后对放线菌菌落计数；在28～30℃条件下培养3～5 d后对霉菌菌落计数。每项试验重复3次。

芽孢杆菌的分离纯化是分别取20mL上述各浓度土壤悬液，经80℃热处理30min后，无菌条件下涂布于牛肉膏蛋白胨培养基制成的平板上，在30℃条件下培养1～2 d后对芽孢杆菌菌落计数。每项试验重复3次。并将上述分离得到的芽孢杆菌菌落通过平板划线稀释法进行纯化，获得相应菌落的纯化菌株。

总菌落数计算方法是选择长出菌落数30～300之间的培养皿进行计数，按以下公式计算总菌数。总菌数（cfu/g）=同一稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数[8]。

1.3.2 微生物类群的划分

依据微生物的形态学、生理学和生态学特征对所获得的菌落进行逐个观察与识别，初步划分为细菌、放线菌和霉菌三大类群。

1.3.3 芽孢杆菌的鉴定

依据菌落形态特征、个体形态特征和生理生化反应进行鉴定。菌落形态特征主要观察菌落的形状、边缘情况、粘稠度、隆起情况、质地及颜色等。个体形态特征主要在高倍镜及油镜下观察单一菌株芽孢的直径、形状、着生位置及与菌体大小的比较。生理生化指标测定主要是对纯化的芽孢杆菌进行糖发酵实验（葡萄糖、阿拉伯糖）、接触酶反应实验、伏普实验（V.P.）、明胶反应实验、淀粉水解实验、苯丙氨酸脱氧实验、硝酸盐还原实验、吲哚实验、柠檬酸盐利用实验[2，9]。

2 结果与分析

2.1 各类群微生物的分离比例

大庆盐碱土中有大量微生物生存。分离的结果表明，1 g碱性土壤中细菌菌落数为8.4×105cfu·g-1，占总菌落的59.45%，其中芽孢杆菌菌落数为6.2×105cfu·g-1，占总菌落的 43.88%；放线菌菌落数为 5.5×105cfu·g-1，占总菌落的 38.92%；霉菌菌落数为 2.3×104cfu·g-1，占总菌落的 1.63%。

2.2 芽孢杆菌的分类鉴定

2.2.1 菌落形态特征的观察结果

通过对平板稀释分离中所得芽孢杆菌菌株的纯化，共得到7个表现不同的芽孢杆菌菌落，编号为1～7号菌株。其菌落形状、边缘情况、粘稠度、隆起情况、质地及颜色见表1。

表1 1～7号芽孢杆菌菌株的菌落形态特征Table 1 Shape of Bacillus clone from 1 to 7

2.2.2 菌株个体形态的观察结果

取以上编号的1～7号菌株，在油镜下观察各菌株的芽孢的直径、形状、着生位置及与菌体大小的比较，结果见表2。

2.2.3 生理生化指标的测定结果

将7株纯化后的芽孢杆菌进行糖发酵实验（葡萄糖、阿拉伯糖）、接触酶反应实验、伏普实验（V.P.）、明胶反应实验、淀粉水解实验、苯丙氨酸脱氧实验、硝酸盐还原实验、吲哚实验和柠檬酸盐利用实验，获得7株芽孢杆菌的部分生理生化特征，结果见表3。

表2 各芽孢杆菌菌株的芽孢形态特征Table 2 Shape of Bacillus spore

表3 各芽孢杆菌菌株的部分生理生化指标Table 3 The physio-biochemistry characteristics of different Bacillus sp.

2.2.4 芽孢杆菌的鉴定结果

由表2，3，4的结果可初步鉴定1～7号菌株依次分别为嗜碱芽孢杆菌（Bacllus alcalophilus），枯草芽孢杆菌（B.subtilis），侧微芽孢杆菌（B.laterosporu），短芽孢杆菌（B.brevi），地衣芽孢杆菌（B.lichenif ormis），环状芽孢杆菌（B.circulans），圆孢芽孢杆菌（B.globisporus.）。在分离得到的芽孢杆菌菌落中，B.brevi出现频率最高，为优势菌株。

3 分析与讨论

在所取得的土样中，分离到了不同的微生物类群，其中细菌与放线菌的比例稍高，而霉菌数量偏低，这可能与大庆盐碱土pH值较高有关，因为霉菌生长的最适宜pH值为5.0～6.5。在盐碱土壤环境中，除了pH较高不适宜霉菌生长外，土壤中的有机质含量也较低，故分离到的霉菌多数为腐生能力较强的根霉与木霉；放线菌由于比较适合干旱和偏高的pH范围，相对来说数量较大。细菌中芽孢杆菌在分离到的细菌中占的比例较高，可达到65%左右，占分离到的微生物数量的40%左右，仅次于放线菌。

参考廖延雄，傅筱冲[10]的双歧氏分类检索系统，对分离到的7种不同菌落形态的芽孢杆菌进行生理生化指标检测，初步试验结果表明，被检测的7种菌落分别归属于7种不同的芽孢杆菌，具体的分类地位归属还有待进一步研究。在分离到的芽孢杆菌菌落中，4号菌株（B.brevi）菌落特征出现的比例较高，可以初步认为B.brevi为芽孢杆菌中的优势种。

［1］崔金香，王帅.土壤微生物多样性研究进展［J］.河南农业科学，2010，22（6）:165-169.

［2］卞立红，高凤清，汪洋，等.大庆盐碱土壤中微生物的分离纯化［J］.高师理科学刊，2010，30（3）:74-76.

［3］周方录，王文键.大庆市南引水库生态环境治理—盐碱土分析与对策［J］.黑龙江水利科技，2006（6）:70-71.

［4］贾立平，顾云杰.大庆地区盐碱土改良利用初探［J］.北方园艺，2000（2）:47-48.

［5］刘秀花.芽孢杆菌的应用究及进展［J］.商丘师范学院学报，2005，21（5）:135-137.

［6］刘国红，林乃铨，林营志，等.芽孢杆菌分类与应用研究进展［J］.福建农业学报，2008，23（1）:92-99.

［7］钟文辉，蔡祖聪.土壤微生物多样性研究方法［J］.应用生态学报，2004，15（5）:899-904.

［8］黄文芳，张松.微生物学实验指导［M］.北京:科学出版社，2006.

［9］布坎南 RE，吉本斯 NE.伯杰细菌鉴定手册［M］.8版.北京:科学出版社，1984.

［10］廖延雄，傅筱冲.芽孢杆菌属（Bacillus）二分检索表［J］.江西科学，1986，16（2）:118-125.