菊芋内生固氮菌分离、鉴定及特性研究

孟宪法，隆小华，康健，王雪晴，刘兆普

（南京农业大学资源与环境科学学院 江苏省海洋生物学重点实验室，江苏 南京210095）

生物固氮是自然界中仅次于光合系统的复杂生物反应系统。它为全球的植物提供了大约75%的氮素，达1.39×108～1.75×108t［1，2］。生物固氮在提高土壤肥力、增强植物抗病能力等方面也发挥着极其重要的作用［3］。1966年，Döbereiner［4］首次成功地从热带禾本科植物点状雀稗（Paspalumnotatum）根际中分离出具有较强固氮作用的雀稗固氮菌（Azotobacterpaspali），并于1976年提出根际联合固氮的概念。1997年Baldani等［5］根据菌体能否定殖（植）在植物组织内，将固氮菌划分为自生固氮菌、共生固氮菌和内生固氮菌。内生固氮菌与植物之间具有联合固氮作用，它存在于植物细胞间隙，是介于根际自生固氮和结瘤共生固氮之间的一种过渡类型［6，7］。内生固氮菌通过分泌植物生长激素等多种生理活性物质，与病原菌竞争营养和空间等方面促进植物生长，在农业生产实践中具有广阔的应用前景［8，9］。近年来，国内外学者对这类非豆科植物特殊的根际联合固氮菌展开了广泛研究，陆续在水稻（Oryzasativa）［10，11］、玉米（Zeamays）［12，13］、甘蔗（Saccharumofficinarum）［14，15］等禾本科植物的组织中分离出植物内生固氮菌。

菊芋（Helianthustuberosus）是菊科向日葵属多年生草本植物，又称洋姜、鬼子姜，为耐寒、耐旱、耐贫瘠、耐盐碱植物［16］。原产北美洲，17世纪传入欧洲，后传入中国。现在在全球的热带、温带、寒带以及干旱、半干旱地区都有菊芋的分布。菊芋生态适应性强，其块茎中富含菊糖，可作为乙醇生产的优质原料［17］。在生产实践中，菊芋施肥量较少，尤其是氮肥，每hm2仅需75kg的尿素［18］，为水稻用量的50%。且生物量巨大，每hm2每年可以收获80 000kg左右的菊芋块茎，以及40 000kg秸秆［19］。这可能是与其自身固氮作用有关，因而本试验对菊芋的内生固氮菌开展研究，探究菊芋内生固氮菌的部分特性，为将来进一步研究和应用奠定基础，也可为开发优质环保的生物菌肥提供菌种资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料 供试材料为南芋一号，2009年10月采集于南京农业大学江苏大丰“863”中试基地。将生长旺盛的菊芋连根拔起，切取其根系，无菌水将附着的泥土清洗干净，立即用灭菌袋密封，途中置于冰盒中保持低温，至实验室后立即放入－20℃冰箱中保存待用。

1.1.2 培养基 Ashby培养基（1 000mL）：用以筛选、培养内生固氮菌的无氮培养基，KH2PO40.2g，CaCO35g，MgSO4·7H2O 0.2g，甘露醇 10g，NaCl 0.2g，琼脂 18g，CaSO4·2H2O 0.1g，pH 7.0±0.2。

Pikovaskaia’s培养基（1 000mL）：用以检测细菌溶解无机磷的能力，Ca3（PO4）23.0g，蔗糖 10.0g，（NH4）2SO40.5g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O 0.1g，KCl 0.2g，酵母粉0.5g，MnSO41mL （4mg／L），FeSO4（Fe·EDTA）0.1mL（2mg／L），琼脂15g，pH 7.0±0.2。

CCM 培养基（1 000mL）：用以检测细菌的IAA分泌活性，甘露醇5.0g，蔗糖5.0g，乳酸0.5mL，MgSO4·7H2O 0.2g，KH2PO40.2g，K2HPO40.8g，CaCl2·2H2O 0.06g，NaCl 0.1g，NaMoO4·2H2O 2.5mg，酵母粉0.1g，Na·Fe·EDTA 4mL（1.64%），NH4NO31g，色氨酸0.1g，pH 7.0±0.2。

1.2 固氮菌分离及固氮酶活性测定

1.2.1 固氮菌的分离 菊芋根系采用流水冲洗1h，稍拭干，称取1g，用70%的酒精浸泡30～60s，2%的NaClO溶液处理5min，进行表面灭菌，无菌水冲洗4次，并将最后1次冲洗过的无菌水进行涂布，检测消毒是否彻底［20］。

消毒后的菊芋根须用无菌的研钵研磨成浆，转入无菌三角瓶中，静置一段时间后，吸取上清液，梯度稀释至10－5～10－8后，分别取100μL涂布于Ashby培养基上，28℃培养3～4d。挑取培养特征相异的单个菌落纯化，镜检，斜面保存。交替在LB培养基和Ashby培养基平板上划线转接7～8次，能够正常生长的菌株为固氮菌株，待测其固氮酶活性。

1.2.2 固氮酶活性检测 纯化得到的固氮菌，利用乙炔还原法检测固氮酶活性，以筛选获得具有高固氮活性的菌株。将LB液体培养的固氮菌，稀释至菌体浓度为108个／mL，取0.5mL稀释菌液与Ashby半固体培养基2 mL混匀后，培养于青霉素小瓶中，封口膜封口，每一菌株3个重复，28℃培养2d。在无菌的条件下将封口膜换成橡胶塞，用石蜡密封，28℃下继续培养2d。用无菌注射器从瓶内抽取0.5mL的空气，随即注入0.5mL高纯度的C2H4，相同温度下培养2d。从瓶中抽取混合气体1mL注入GC5890C型气相色谱议中检测乙烯含量。色谱条件：氧化铝柱长3m，内径0.53mm，柱温为55℃，检测器温度为220℃，进样器温度为160℃，载气为N2，检测器为火焰离子发生器（FID）。按下式计算固氮酶活性［21］。

其中，hx：样品峰值；hs：标准 C2H4峰值；c：标准 C2H4浓度（nmol／mL）；v：培养容器体积（mL）；t：样品培养间（h）；N：产生的C2H4浓度（nmol／mL·h）；24.9：常数，为标准浓度的C2H4在30℃下测试时的体积（mL）。

1.3 固氮菌菌株鉴定［21］

鉴定所得菌株的菌落形态、对各种碳源的适应性、耐盐性以及各种生化反应，以明确菌株的形态特性，生理生化特性等。通过菌株16SrRNA的检测分析，确定其菌属。

1.3.1 菌落形态特性 取0.1mL菌体浓度为108个／mL的稀释菌液，涂布于LB培养基上，28℃恒温培养2d后观察菌落形态特性。

1.3.2 生理生化特性 唯一碳源试验：分别以葡萄糖、麦芽糖、乳糖、菊糖、蔗糖、甘露醇作为唯一碳源取代Ashby培养基中的蛋白胨，接种固氮菌，28℃恒温培养2d后，观察其生长情况。

耐盐性：制备供试菌株的稀释菌液，取0.1mL分别涂布于NaCl浓度为3%～8%的牛肉膏蛋白胨培养基上，28℃恒温培养2d后观察菌落生长情况。

生化反应测定：按照东秀珠和蔡妙英［22］及周德庆［23］的试验方法，分别检测供试菌株的油脂水解试验、M.R.试验、V.P.试验、明胶分解试验、H2S的产生、吲哚试验、淀粉水解酶试验、过氧化氢酶试验及革兰氏染色等生化反应特性。

1.3.3 16SrRNA 序列检测 使用16SrDNA 的通用引物，进行 PCR 扩增，引物序列：引物1，27f：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′，引物2，1 492r：5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′［24］。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。扩增程序为：95℃预变性5min；94℃变性40s，58℃退火30s，72℃延长1.5min，30个循环；72℃下延伸8min。扩增后，取5μL的扩增样品在1%的琼脂糖凝胶上130V电压下进行电泳检测，将亮度好、纯度高的特异性条带（1 500bp左右）回收之后，置于－20℃下保存，送往上海美季生物技术有限公司测序，所得基因序列与GeneBank报道序列进行同源性分析。

1.4 固氮菌解磷性及分泌植物生长激素特性检测

检测固氮菌株对无机磷的分解作用以及菌株自身分泌吲哚乙酸（IAA）的特性，以利于进一步探究固氮菌对菊芋的促生机理。

1.4.1 解磷性检测 将1mL供试菌株的悬浮液（1×108个／mL），接种于50mL Pikovaskaia’s液体培养基中，每一菌株3个重复，置于摇床上，28℃，160r／min，培养10d之后，在4℃下10 000r／min离心15min，对照组除不接种菌株外，处理相同。采用钼酸铵比色法测定有效磷（P）的含量［25］，标准曲线采用KH2PO4制作。取1mL上清液，5mL钼锑抗显色液，定容至50mL，30℃水浴30min后，在700nm波长下，进行比色。

1.4.2 IAA分泌特性检测 将1mL供试菌株的悬浮液（1×108个／mL）接种于盛有50mL CCM液体培养基的三角瓶中，每一菌株3个重复，置于摇床上28℃，160r／min培养12d，对照除不接种菌株外，处理相同。将菌株培养液在4℃10 000r／min离心10min。采用Salkowski比色法［26］测定其产生植物生长激素的能力，标准曲线采用3－IAA制作。取1mL上清液加比色液（0.5mol／L FeCl32mL，高氯酸100mL）后，在黑暗中静止0.5h后，在530nm波长下，进行比色。

2 结果与分析

2.1 固氮菌分离及固氮酶活性

通过对根内固氮菌的分离、纯化，得到了7株固氮酶活性较高的菌株，编号为cho1～cho5、cho7和cho9。它们之间的固氮酶活性相差较大，为26.74～207.34nmol／（mL·h）。固氮酶活性较高的菌株较少，只有cho1和cho9的固氮酶活性高于100nmol／（mL·h）。菌株cho1的固氮酶活性为207.34nmol／（mL·h），与其他菌株差异显著（表1）。

2.2 固氮菌形态学、生理生化特性及16SrRNA鉴定

2.2.1 菌落特性 筛选得到的固氮菌株菌落均呈圆形，表面光滑，粘稠，易挑起，但颜色差异较大。菌株cho2和cho7的生长速度较慢，菌株cho3则可以在LB培养基上快速生长（表2）。

表1 菊芋内生固氮菌固氮酶活性Table1 Nitrogenase activity of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke nmol／（mL·h）

表2 菊芋内生固氮菌菌落形态特性Table 2 Colony morphology of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

2.2.2 生理生化特性 碳源利用特性结果分析表明，待测菌株均对葡萄糖、麦芽糖和蔗糖具有较高的适应性；菌株cho2和cho4在以乳糖为碳源的培养基上生长不良；菌株cho2在以甘露醇为碳源的培养基上生长不良；菌株cho2和cho7在以菊糖为唯一碳源的培养基上适应性较差，表现为不生长或生长不良，可见不同菌株对碳源的利用存在着差异（表3）。

表3 菊芋内生固氮菌对不同碳源利用特性Table 3 Utilization characteristics of different carbon sources by the endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

待测固氮菌株均能在盐浓度为5%及以下的培养基上生长，但随着盐浓度的增加，不同菌株间耐盐性差异较大。cho7和cho9具有较高的耐盐活性，cho4可以在富盐培养基上正常生长。当盐浓度到达8%时，菌株均不能生长（表4）。

待测菌株均具有分解色氨酸产生吲哚的能力，并可以产生过氧化氢酶，且均为革兰氏阴性菌；只有菌株cho1、cho3、cho4、cho9可以分解硫氨基酸产生 H2S；固氮菌在油脂、明胶、淀粉等水解试验中表现各不相同，葡萄糖水解产物也各不相同（表5）。

2.2.3 16SrRNA序列 测序结果在GenBank数据库中进行比对，结合固氮菌的生理生化特征（表5），本研究分离筛选出的固氮菌菌株cho1、cho4属于根瘤菌属；菌株cho2、cho5、cho7属于寡养单胞菌属；菌株cho3属于假单胞菌属；菌株cho9属于肠杆菌属（表6）。

表4 菊芋内生固氮菌对NaCl的耐受性Table 4 NaCl tolerance of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

2.2.4 固氮菌解磷性及分泌植物生长激素特性 待测固氮菌，均具有分泌生长素的能力，产生的IAA浓度为2.67～13.49μg／mL，其中以cho2为最高；除菌株cho3和cho5不具有解磷活性外，剩余5株固氮菌均具有分解无机磷的活性，但解磷活性差异较大（表7）。

3 讨论

氮肥在菊芋生物量积累中，起着至关重要的作用［19］。内生固氮菌定植于宿主植物体内，受到保护的同时，可有效的为植物提供氮素营养，且不需要与特异性宿主结成根瘤，提高了内生固氮菌的应用范围。同时内生固氮菌大多数还具有溶解有机磷、矿物磷，以及分泌植物激素的特性，增强了植株的抗病性和适应性［7］。在研究中发现，菊芋对土壤肥力要求低，可以在少量施加甚至不施加氮肥的中度和轻度盐碱地生长良好。在施氮量不足的条件下，菊芋的总生物量可以达到15 000kg／（hm2·年）以上，土壤中氮素处于净消耗状态［27］。从微生物角度入手，在发现菊芋根际固氮菌的数量没有显著增加的情况下，从根系中分离得到了7株性状良好的内生固氮菌，分别为2株根瘤菌属，3株寡养单胞菌属，1株假单胞菌属和1株肠杆菌属。与禾本科植物相比，菊芋根系中的内生固氮菌的种类较为单一，除常见的内生固氮菌［28，29］，如根瘤菌、假单胞杆菌和肠杆菌外，首次发现嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonasmaltophilia）。

表5 菊芋内生固氮菌的生化反应特性Table 5 Biochemical characteristics of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

表6 菊芋内生固氮菌菌株名录Table 6 Name list of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke

表7 菊芋内生固氮菌的解磷性及产生的IAA浓度Table 7 P dissolution ability and concentration of IAA in exudates of endophytic bacteria strains isolated from jerusalem artichoke μg／mL

菊芋内生高固氮酶活性的菌株较少，但性状良好，它们具有较好耐盐能力，均可在5%的NaCl浓度下正常生长，菌株cho4甚至可以在7%的高盐培养条件下生长。除cho3和cho5外的固氮菌，均具有解磷活性，可以分解土壤中的难溶无机磷，将之转变为植物可以吸收利用的有效磷素，以利于菊芋在磷素较少的土壤中生长。所得菌株均具有较高的IAA分泌的特性，分泌的IAA可促进菊芋生长，也可促进菊芋根系对土壤中的水分和养分的吸收并可为有益菌附生创造有利条件，这与许多学者的研究结果相一致［30］。

综上，试验中从菊芋根部筛选得到的固氮菌株，具有高效的固氮酶活性，能够从空气中固定大量的氮。这使菊芋具备了耐贫瘠的特性，即使不施加氮肥，也可以积累较高的生物量。同时，菌株还具有良好的解磷性和植物激素的分泌特性，增强了菊芋的抗逆性，也是菊芋粗放种植、适合盐碱化土壤生长非耕地的可能原因之一。

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