两种策略分别克隆紫花苜蓿光敏色素A、B基因

李平，杨玲玲，陈其新，史莹华，严学兵，陈占宽，王成章＊

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南 郑州450002；2.河南省农作物新品种重点实验室，河南 郑州450001）

紫花苜蓿（Medicagosativa）是世界公认的一种多年生优质豆科牧草，被誉为“牧草之王”［1］，其在我国草产业中的重要性日益凸现［2］，苜蓿产业也正逐步发展成为我国农业领域的新兴产业［3］。苜蓿的秋眠性（fall dormancy，FD）是苜蓿在秋季日照长度变短和气温下降时的一种适应性生长特性［4，5］。研究表明，苜蓿的秋眠性与抗寒性［6，7］、生产性能［8－12］等相关，因此，很多国家都将其作为苜蓿栽培选择品种时的首要指标［7］，也成为苜蓿研究中的热点和重要参考性状［13，14］。尽管对苜蓿秋眠性的机理尚存争议，但目前被广泛接受的观点为苜蓿秋眠是一种光周期反应（photoperiod response）［4，5，7］，不同秋眠型苜蓿品种对光周期反应的差异与它们原产地生长季节的自然日照长度有很大关系，是植物对环境条件长期适应的结果。因此，从光周期角度研究光受体与苜蓿秋眠性的关系可能是揭示苜蓿秋眠性机理的有效途径之一。

植物接收光周期信号主要是通过光受体（photoreceptor）来实现的。通过光受体，光才能与植物内源的发育程序相互作用，调节相关基因的表达［15］。目前，已知至少存在4类感受不同波长的光受体：光敏色素（phytochrome，PHY），主要感受红光（620～700nm）和远红光（700～800nm）；隐花色素（cryptochrome，CRY）和向光素（phototropin，PHOT，也称作NPH1），感受蓝光（380～500nm）和近紫外光 （UV－A，320～380nm）；一个或几个尚未鉴定的紫外光B（UV－B）受体，感受紫外光B区域（280～320nm）的光［16］。光敏色素是植物体内最重要也是目前研究最为深入的一类光受体［17］，它们的发现被认为是植物光形态建成研究的里程碑［18］。光敏色素是一个较为复杂的基因家族，拟南芥（Arabidopsisthaliana）PHY家族至少包括5个执行不同生理功能的成员（PHYA，PHYB，PHYC，PHYD，PHYE），其中尤以PHYA、PHYB研究最为深入［19］。

采用酶联免疫测定法（enzyme－linked immunosorbent assay，ELISA）研究了3个不同秋眠型苜蓿品种在8，12和16h光照条件下叶片和顶芽中的PHYB含量。结果表明，3个品种均是在8h光照下PHYB合成量高，而且秋眠型比非秋眠型苜蓿叶片中PHYB含量高。由此推测，PHYB作为绿色植物主要光受体，可能通过光周期（短日照）参与苜蓿秋眠的调控［20，21］。另外，PHYA也是一种重要的光敏色素，已有研究证实PHYA与PHYB共同参与了植物的多种生理反应［22－24］，因此，推测PHYA也可能参与苜蓿秋眠的调控。

利用模式物种已知基因信息资源克隆近缘物种未知基因是一种常用而且高效的方法。紫花苜蓿虽是非常重要的豆科牧草，但其已经测定的基因资源却非常有限。幸运的是，与紫花苜蓿同属的蒺藜苜蓿（Medicagotruncatula）是一种即将完成全基因组序列测定的豆科模式植物，具有大量的基因信息资源（www.medicago.org），两者具有非常近的亲缘关系［比其他豆科模式物种如豌豆（Pisumsativum）、百脉根（Lotuscorniculatus）、大豆（Glycinemax）亲缘关系更近］，两者二倍体的染色体数相同且基因具有高度的共线性，基因组具有非常高的同源性［25－28］，例如几丁质酶基因在氨基酸水平同源性达到98%［29］。因此，对于欲研究的未知紫花苜蓿基因，可以通过预测或查找蒺藜苜蓿相关基因，然后将其近似假定为未知的紫花苜蓿基因和最重要参考序列，再以之作为模板设计引物进行PCR反应，从而直接克隆得到紫花苜蓿基因序列。这种策略将“未知基因”变成“已知基因（近似基因）”，引物为特异引物而非简并引物，仅需普通PCR反应即可得到基因部分或全长序列，因而将是克隆紫花苜蓿未知基因的一条捷径。

目前，紫花苜蓿的PHYA和PHYB基因都尚未被克隆。本研究采用2种不同的策略对紫花苜蓿PHYA和PHYB基因进行了克隆。其中，PHYA采用较为常用的方法，以mRNA为起点，运用反转录－聚合酶链式反应（reverse transcription－polymerase chain reaction，RT－PCR）和cDNA 末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends，RACE）获得PHYAcDNA主体序列，辅以染色体步移法获得PHYA5′端序列；PHYB则根据比较基因组学和生物信息学的有关原理，首先预测蒺藜苜蓿PHYB基因，然后以预测的蒺藜苜蓿PHYB基因序列设计引物直接扩增得到紫花苜蓿PHYB基因主体序列，再使用染色体步移法得到该基因的5′端序列。本研究最终获得PHYA的cDNA基因全长和PHYB基因的近全长序列，为进一步利用分子生物学手段探究这2种光敏色素基因在苜蓿秋眠性调控机制中的作用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 2007年7月，将紫花苜蓿品种 WL－525HQ盆栽于实验室，根据试验需要随时摘取其茎端叶片提取总RNA和基因组DNA。

1.1.2 主要试剂 快捷型植物基因组DNA提取系统（目录号：DP321）、DNA凝胶回收试剂盒（目录号：DP209）、质粒抽提纯化试剂盒等购自天根生化科技（北京）有限公司；总RNA提取试剂（RNAiso Plus，目录号：D9108A）、反转录试剂盒（目录号：DRR023）、3′－Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒、5′－Full RACE Kit试剂盒、染色体步移试剂盒（genome walking kit，目录号：D316）、LA Taq（目录号：DRR02）、pMD19－T载体（目录号：D102）、感受态细胞JM109（目录号：D9052）、DNA Marker等购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR引物合成和测序主要由北京三博远志技术服务有限责任公司和宝生物工程（大连）有限公司完成。

1.1.3 引物设计 参考GenBank中发表的有关基因序列，使用Oligo（Version 6.54）软件设计引物。

1.2 RNA和DNA的提取

1.2.1 植物总RNA的提取 将约25mg新鲜的紫花苜蓿茎顶端叶片迅速转移至用液氮预冷的研钵中研磨至粉状，按照RNA提取试剂盒（Takara，RNAiso Plus）的操作说明提取总RNA。

1.2.2 植物基因组DNA的提取 取紫花苜蓿茎顶端新鲜叶片约100mg在液氮中研磨至粉状，之后按试剂盒（天根快捷型植物基因组DNA提取系统）说明书进行操作。

1.3 紫花苜蓿PHYA基因的克隆

1.3.1 紫花苜蓿PHYAmRNA基因片段的克隆 因为目前尚无有关紫花苜蓿PHYA基因序列的报道，因而，本研究根据GenBank已发表的与苜蓿亲缘关系较近的其他豆科植物（主要参考大豆和豌豆）的PHYA基因序列的保守区域设计1对PCR引物，序列为，F1：TTGGGGTTTGGTAGTTTGCCAT；R1：AGCCTTGAATGATGATCTTG GATGC。反转录用Random 9mers作引物，反应条件：65℃1min，30℃5min，25min匀速升温至65℃，然后65℃20min，98℃5min，5℃5min。PCR扩增按照94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃45s，30个循环；72℃5min进行。对扩增产物先进行琼脂糖凝胶电泳检测，然后用凝胶纯化回收试剂盒回收预期的目的DNA片段，委托北京三博远志技术服务有限责任公司进行测序。

1.3.2 紫花苜蓿PHYA3′RACE 采用3′－Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒。根据获得的PHYA基因片段序列，设计3′RACE套式PCR特异性引物，Outer和Inner引物序列分别为：3OTGTGCGATATGCTGATGCGAGAT，3IAGATAAGAGAGATAGCTTTATGGATGTCCGAG。具体操作基本按照试剂盒说明书进行，其中，反转录体系为10μL，反应条件为42℃60min，70℃15min；套式PCR Outer反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。之后取Outer PCR产物1μL作为模板进行Inner反应，条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环；72℃10min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，割胶回收目的片段，再进行连接、转化、克隆和测序。

1.3.3 紫花苜蓿PHYA5′RACE 采用5′－Full RACE Kit试剂盒。根据获得的PHYA基因片段序列，设计5′RACE套式PCR特异性引物，Outer和Inner引物序列分别为：5OACAGCTGCCATTCCACATACAGT，5I CGTCGAT CCTAATATCCATAACTTG。按照试剂盒说明书进行操作。主要步骤包括去磷酸化处理、“去帽子”反应、5′RACE Adaptor的连接、反转录反应、Outer PCR反应和Inner PCR反应。其中 Outer PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃150s，20个循环；72℃10min。Inner PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃150s，25个循环；72℃10min。扩增产物进行电泳分离、回收、连接、转化、克隆和测序。

1.3.4 紫花苜蓿PHYA5′端染色体步移 将以上克隆得到的3个PHYA序列片段，通过拼接和分析比对后发现5′RACE并未得到5′端cDNA全长，而是缺失了约367bp的编码（coding sequence，CDS）序列，重复1次试验后仍未得到理想结果，于是改用染色体步移法获得5′端缺失的CDS序列。引物设计模板为上述克隆拼接得到的cDNA序列，第1，2，3轮特异引物分别为 A53CACTATCTCCATCTTCATCGCTGTC、A52GGGA ATATCTGTGGCCGGATAGTG和A51CGGTAACACGGTGAATAATCGCAT。具体操作按照染色体步移试剂盒（genome walking kit）说明书进行，其中，以 WL－525HQ基因组DNA为模板，以试剂盒提供的 AP引物1，2，3，4作为上游引物分别与3轮特异引物进行PCR反应，延伸时间为2min。3轮反应后，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析，将效果最好（条带亮、单一）的AP引物1与A51引物组合的第3轮PCR产物分离、克隆和测序。

1.4 紫花苜蓿PHYB基因的克隆

通过预测与紫花苜蓿同属的蒺藜苜蓿的PHYB基因，然后以其为参考序列，设计引物进行PCR反应，从而直接克隆得到紫花苜蓿PHYB基因序列。

1.4.1 蒺藜苜蓿PHYB基因预测 在通过与几种近缘物种已测序PHYB基因的反复比对及在GenBank非冗余核苷酸数据库中使用Blastn搜索后，发现在登录号为AC152185的蒺藜苜蓿细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）克隆测序结果中，在第25 551～32 007位碱基，有1段长度为6 457bp的序列，注释为“GAF；heavy metal sensor kinase”基因（尚无中文翻译，可暂译为“重金属感受器激酶”），编码蛋白登录号为：ABN07956.1，全长1 152个氨基酸。经查，光敏色素基因中包含GAF区（GAF domain）。这段序列与豌豆、大豆和百脉根的PHYB基因高度相似且长度、结构都非常吻合，将此段序列通过Blastx比对后，推测该段序列极可能为蒺藜苜蓿的PHYB基因，而并非注释的“GAF；heavy metal sensor kinase”基因（尽管光敏色素中包含GAF区，但并不能用GAF代表整个基因），经与其他物种PHYB基因序列比对分析后可知该序列方向与mRNA序列相反，应为mRNA序列的反向互补序列。为进一步验证其可靠性，将该序列用FASTA－Protein程序（http：／／www.ebi.ac.uk／Tools／fasta33／）进行比对，得到与Blastp非常近似的结果，即：该段序列所编码的氨基酸序列与以下几种植物的PHYB相似性很高，由高到低依次为：豌豆（93%）、百脉根（88%）、大豆（87%）和葡萄（Vitis vinifera）（80%）（后略），由注释信息可知，该基因由4个外显子和3个内含子组成。为进一步验证该基因注释的外显子与内含子边界的正确性，采取了3种验证方式：1）通过GENSCAN（http：／／genes.mit.edu／GENSCAN.html）在线服务分析，Organism选择“拟南芥”（玉米预测效果较差），对比发现前3个外显子与“GAF；heavy metal sensor kinase”注释相一致，而最后1个外显子不符。2）对后段GENSCAN预测不准区域通过氨基酸序列tBlastn查找最后1个外显子在核苷酸序列中相应的位置。3）应用GT－AG规则对整个基因的外显子－内含子边界进行验证。通过验证，认为在GenBank中登录号为AC152185、名为“GAF；heavy metal sensor kinase”的基因，实际上应为PHYB基因，而其关于基因长度及内含子、外显子边界等相关注释是可信的，于是得到预测的蒺藜苜蓿PHYB基因的CDS（3 459bp）和包含了内含子的基因组序列（6 457bp）。

1.4.2 紫花苜蓿PHYB基因主体序列的克隆 直接以预测的蒺藜苜蓿PHYB基因CDS序列为模板，设计了2对能部分重叠的PCR引物（因基因较长，采用分段克隆再拼接的策略），分别为：LU1CCTGAACAACAGATCACT GCTTAC、17UCAAGCACCTCTTCTCCCACC 和 HU1TTCAGTTAGCCGCACAGTCGTT 与 HL2 CTTCTCC GCGTCACAGGTAGTTC。基因组DNA提取见1.2.2（下同）。LU1与17U组合的PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃5min。HU1与 HL2组合的PCR反应条件为：94℃1min；98℃10s，68℃6min，30个循环；72℃10min。目的产物分别进行克隆和测序。

1.4.3 紫花苜蓿PHYB5′端染色体步移 通过对上述1.4.2中获得的序列进行拼接，得到了紫花苜蓿PHYB的主体序列，3′端与预测的蒺藜苜蓿PHYB相差仅19bp，而5′端相差约300bp，为给下游试验提供尽量长的序列信息和获得可能的PHYB启动子序列，使用染色体步移法对PHYB5′端序列进行克隆。引物设计模板为上述1.4.2中克隆拼接得到的CDS序列，第1，2，3轮特异引物分别为B52TGACAACCATGAGGAGCACGAAGCG、B53AACCTCGACGCCTGCGGTATATCAGT和B54CCCATATACGGCTCCAAATCAATC。其余操作同1.3.4，将效果最好的AP4引物第3轮PCR产物克隆和测序。

2 结果与分析

2.1 获得紫花苜蓿PHYA基因cDNA全长序列

使用引物F1和R1进行RT－PCR扩增得到与预期扩增长度相符的约570bp的cDNA片段（图1）。测序后获得了长度为549bp的cDNA片段，Blast比对结果证实这个cDNA片段与其他已克隆的PHYA基因具有很高的相似性，说明是PHYA基因片段的序列。根据此片段设计特异引物3O和3I、5O和5I，用RACE技术扩增到此基因的5′和3′末端序列（图2和3）。将这3个片段的序列进行拼接，得到长度为3 130bp（GenBank登录号为GQ379905）的PHYA基因序列。而后，使用染色体步移法克隆得到了1 260bp的5′端序列（图4）（Gen－Bank登录号为GQ379904），补齐了此前缺失的5′端序列。再经过分析比对和拼接剪切，得到了紫花苜蓿PHYACDS全长，共3 375bp，编码1 125个氨基酸。经分析，紫花苜蓿PHYA基因与已知的GenBank中的植物PHYA基因的相似性都比较高（大多在75%以上），与豌豆、百脉根、山黧豆（Lathyrussativus）等豆科植物都达到92%以上。

图1 PHYART－PCR扩增产物Fig.1 PHYART－PCR amplification

图2 PHYA3′RACE－PCR扩增产物Fig.2 PHYA3′RACE－PCR amplification

2.2 获得紫花苜蓿PHYB基因组DNA近全长序列

图3 PHYA5′RACE－PCR扩增产物Fig.3 PHYA5′RACE－PCR amplification

图4 PHYAgenome walking扩增产物Fig.4 PHYAgenome walking amplification

图5 PHYBPCR扩增产物Fig.5 PHYBPCR amplification

使用2对引物LU1、17U和HU1、HL2进行PCR扩增，分别得到与预期扩增片段相符的2个片段（图5和6）。测序结果表明，两片段长度分别为1 097和4 997bp。染色体步移获得了1 752bp的5′端序列（图7）。将3段序列拼接后得到长度为7 150bp的基因序列（登录号 GQ379902），其中包含了5′端非翻译区（UTR）、3个内含子和长度为3 425bp的CDS序列（编码1 141个氨基酸），达到预测的蒺藜苜蓿PHYB基因编码序列的99.0%。将紫花苜蓿PHYBCDS序列与编码氨基酸序列分别进行Blastn和Blastp，得到的相似性由高到低分别为：蒺藜苜蓿预测PHYB（97%）、豌豆PHYB（91%）、大豆PHYB（86%）和百脉根PHYB（85%）；蒺藜苜蓿预测PHYB（97%）、豌豆PHYB（93%）、百脉根PHYB（89%）和大豆PHYB（88%）。

图7 PHYBgenome walking扩增产物Fig.7 PHYBgenome walking amplification

分析发现，紫花苜蓿PHYB与预测的蒺藜苜蓿PHYB，不仅基因结构及其保守区序列十分相似，并且在非编码区的基因序列相似性也很高。紫花苜蓿PHYB5′端上游长度为886bp的序列与预测的蒺藜苜蓿PHYB5′端上游序列相似性达到78%，一致性（Identities）＝630／804，两者内含子序列相似性也接近90%。非编码区具有这样高的序列相似性，说明可以尝试在蒺藜苜蓿已知或预测基因的CDS外端设计引物，这样会使引物设计的范围拓宽，就可能直接克隆出未知紫花苜蓿基因的全长，从而省去RACE和染色体步移等操作，大大提高试验效率，节约试验成本。

3 讨论

本研究采用了2种基因克隆策略分别克隆紫花苜蓿PHYA和PHYB基因，现对两者进行比较：1）PHYA和PHYB分别以mRNA和基因组DNA为试验起点，前者由于mRNA容易降解，因此对操作和试验条件要求较高，而且进行PCR前需要反转录；后者可获得内含子等更多基因信息，但内含子较大时也会增大克隆难度和测序成本。2）对于PHYA，先根据近缘物种已知PHYA基因序列在保守区设计引物RT－PCR扩增出一段序列，然后用3′RACE和5′RACE向两端延伸；对于PHYB，先预测蒺藜苜蓿PHYB，然后直接以之设计PCR引物克隆得到紫花苜蓿PHYB的大部分序列，最后再用染色体步移法补齐5′端序列。两者所采用的RACE和染色体步移法，尽管原理不同［30，31］，试验起点不同，但都是根据已知序列片段向两侧延伸从而克隆未知区域序列的常用方法［32－34］。其中PHYA5′RACE未得到理想的结果（获得5′cDNA全长），原因可能是多方面的，包括操作步骤较多、试验条件要求高、试剂较为昂贵等［35］；而染色体步移法操作较为简单，试验条件要求较低，试验成功率高，试剂成本较低，所以可优先作为克隆基因未知区域序列的方法。3）2种策略的本质差别在于前者只是按照克隆未知基因的一般思路和模式，后者则是充分利用蒺藜苜蓿与紫花苜蓿基因组的高度相似性，将“未知”变成“已知”，将未知基因的克隆变成了“已知（或准已知）”基因的克隆，这样，无论采用mRNA还是基因组DNA为试验起点，都可以通过查找或预测蒺藜苜蓿对应基因，然后直接应用或作为最重要的参考序列来克隆紫花苜蓿目的基因，这样往往会使克隆难度大大降低，从而快速高效的完成试验；但后者对试验人员的理论基础、生物信息学操作和分析能力要求较高，前期需要进行细致的分析和基因预测等工作。所以，针对特定的试验条件、目的和研究背景，2种策略各有优劣。综上所述，当前紫花苜蓿基因信息资源短缺，却拥有大量可以利用的蒺藜苜蓿基因信息资源，在这种情况下，应充分利用蒺藜苜蓿资源研究紫花苜蓿，这非常适用于紫花苜蓿未知基因的克隆，同理，也适用于紫花苜蓿研究的其他很多方面［36］，例如用于蒺藜苜蓿的基因芯片同样可适用于紫花苜蓿［37］等，因此，在进行某些紫花苜蓿相关研究时，可以先对蒺藜苜蓿进行研究，而后再应用于紫花苜蓿，可能绕道蒺藜苜蓿后，反而加快了研究进程。

植物接受环境中光信号并调节自身生理反应的机制是非常复杂的，常常有多种光受体共同参与和调控［24，38，39］，例如隐花色素和光敏色素一起调节植物的去黄化反应、光周期反应和光形态建成反应［15，18，22］。因此，欲探究光与苜蓿秋眠性的关系，除了光敏色素中的PHYA、PHYB外，还应将其他可能存在的光敏色素以及隐花色素、向光素甚至紫外光受体等其他光受体列入研究范围。

本试验使用2种策略克隆了紫花苜蓿PHYA和PHYB基因，所得序列均可以满足下游实时定量PCR（Realtime PCR）和RNA干扰（RNAi）试验要求，为进一步研究两基因的功能及其与苜蓿秋眠的关系奠定了基础；同时证明利用豆科模式植物蒺藜苜蓿已知基因组信息资源克隆紫花苜蓿未知基因的方法是可行和高效的，从而为克隆紫花苜蓿其他未知基因及其他方面研究提供思路和参考。

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