致敏树突状细胞疫苗抗小鼠乳腺癌的实验研究

黄宏思 黄衍强 韦连登

（右江民族医学院微生物学与免疫学教研室，广西 百色 533000）

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是目前已知的人体内功能最强大的、能唯一激活静息期T细胞的专职抗原呈递细胞，具有强大的激活CD8+细胞毒性T细胞（CTL）及CD4+辅助性T细胞的能力。近年来，以DC为基础的免疫治疗作为一种主动特异性细胞免疫治疗，逐渐成为人们关注的焦点。国内外的医学研究者尝试在体外用多种肿瘤抗原致敏DC，然后将其回输体内，望以此打破宿主对肿瘤的耐受，激发针对肿瘤的主动特异性细胞免疫。本实验采用将小鼠EMT6乳腺癌细胞株注射到BALB/c小鼠皮下的方法建立小鼠乳腺肿瘤模型，然后观察乳腺癌抗原致敏树突状细胞疫苗对小鼠移植瘤是否有抗肿瘤作用[1-4]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物及细胞株

BALB/c雌性小鼠，6～8周龄，体质量18～22g，购自广西医科大学实验动物中心。小鼠EMT6乳腺癌细胞株购自中国医学科学院肿瘤研究所。

1.1.2 主要试剂及仪器

含10%小牛血清的RPMI1640培养液、重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rmGM-CSF）和重组小鼠白细胞介素4（rmIL-4）等购自美国Biosouce。LDH试剂盒购自南京建成公司。酶标仪为美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DC的分离及培养

参照文献[2]采用骨髓分离法并稍作改进。取BALB/c小鼠颈椎脱臼法处死：浸入75%酒精中5～10min，无菌手术取出股骨；剪去长骨骨端，冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白；收集骨髓细胞，低渗分离去除红细胞，洗涤离心后用RPMI1640培养液重悬细胞，冲洗后按500U/mL rmGM-CSF和200U/mL rmIL-4的终浓度加入培养体系，37℃、5%CO2培养备用。

1.2.2 DC疫苗的制备

取对数生长期的EMT6细胞反复冻融[5,6]获得肿瘤细胞冻融粗提全抗原，于-20℃保存备用。按DC与肿瘤细胞为1∶3的比例向DC培养瓶中加入肿瘤细胞冻融抗原，继续培养48h，此时的DC即为经肿瘤抗原致敏的DC疫苗。

1.2.3 检测DC诱导CTL的杀伤活性

将24只小鼠随机分成4组，每组6只。分别在每组小鼠皮下分别注射PBS、冻融肿瘤抗原、未致敏DC和致敏DC，免疫7d后处死小鼠，无菌收集脾脏淋巴细胞作为CTL效应细胞，另取EMT6细胞为靶细胞，将效：靶细胞按100∶1、50∶1和25∶1的比例置于96孔板，放入培养箱内孵育24h。采用定量乳酸脱氢酶（LDH）法检测CTL杀伤活性，本实验复3次，D波长490nm。

CTL杀伤率=（实验组D值-自然释放组D值）/最大释放组D值×100%。

1.2.4 荷瘤小鼠模型的建立

冻存EMT6细胞常规复苏培养并传代，细胞生长至80%～90%，倾去培养液，Hanks液漂洗。2.5g/L胰蛋白酶37℃消化至细胞皱缩变圆。倾去胰酶，加入无血清培养基轻柔吹打形成细胞悬液，离心800r/min 3min。弃上清，再次加入无血清培养基重悬细胞。台盼蓝染色计数细胞，检测活细胞比例大于95%，并调整细胞数为1×106/mL。

1.2.5 体内抑瘤效果检验

将32只小鼠随机分成4组，每组8只。实验第1d，于各小鼠右前腋下皮下接种处于对数生长期的EMT6细胞（1×106个/只）。次日，于各组小鼠同侧右前腋下皮下分别注射PBS、冻融肿瘤抗原、未致敏DC和肿瘤抗原致敏的DC疫苗，注射剂量为1×106个DC/只。然后于第7d和第14d分别强化注射1次，剂量同上。当皮下肿瘤可触及后，用卡尺测量肿瘤的纵径和横径，通过公式1/6πab2估算肿瘤体积（a为长轴纵径，b为短轴纵径）。

1.3 统计学处理

使用SPSS12.0统计软件统计分析，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DC诱导CTL的杀伤活性的检测

当效：靶比为100∶1时，与PBS对照组比较，抗原致敏的DC细胞诱导的CTL体外对肿瘤细胞有明显的杀伤作用；而未经抗原致敏的DC组和单纯肿瘤抗原组与PBS对照组间无显著性差异。见表1。

表1 CTLs对靶细胞的细胞毒活性（±s，n=9，D490）

表1 CTLs对靶细胞的细胞毒活性（±s，n=9，D490）

注：*：与PBS对照组比较，P＜0.05；#：与PBS对照组比较，P＞0.05

组别 EMT6 100∶1 50∶1 25∶1 PBS对照组 17.3±3.7 10.5±4.3 5.7±3.8未经抗原致敏DC组 20.7±4.9# 16.7±5.2 11.9±4.7单纯肿瘤抗原组 26.4±5.2# 20.4±4.3 9.5±3.6抗原致敏DC组 40.8±5.6* 35.6±5.4 24.6±5.7

2.2 DC疫苗体内抗肿瘤效果检测

观察小鼠荷瘤21d。肿瘤抗原致敏DC免疫小鼠组的肿瘤生长得到明显抑制，体积为（0.248±0.027），与PBS对照组（0.826±0.061）间有显著性差异；而单纯肿瘤抗原组及未致敏DC免疫小鼠组，虽然肿瘤也得到一定的抑制，但与PBS对照组间无显著性差异。见表2。

表2 DC疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用（±s，n=9）

表2 DC疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用（±s，n=9）

注：*：与PBS对照组比较，P＜0.05；#：与PBS对照组比较，P＞0.05

肿瘤体积（cm3）组别 7d 14d 21d 28d PBS对照组 0.121±0.0620.265±0.057 0.826±0.061 1.004±0.071未经抗原致敏DC组 0.153±0.0480.169±0.0720.714±0.059#0.837±0.053单纯肿瘤抗原组 0.109±0.0760.237±0.054 0.607±0.062#0.752±0.065抗原致敏DC组 0.051±0.0430.112±0.0360.248±0.027*0.392±0.041

3 讨 论

树突状细胞（DC）是由美国学者Steinman于1973年发现的，是目前所知的机体内功能最强的专职抗原提呈细胞，它具有激发T细胞免疫应答，诱导对自身抗原耐受等功能。DC系统作为机体内免疫应答的始动子和调节子，具有强大的激活CD8+CTL和CD4+辅助性T细胞的能力，控制着体内免疫应答的过程，因而成为抗肿瘤免疫应答的中心环节。近年来，随着体外大量扩增DC和制备DC疫苗技术的日趋成熟，采用DC疫苗进行抗肿瘤治疗，包括抗乳腺肿瘤治疗已成为当今肿瘤生物治疗领域备受关注的焦点之一[7-9]。

单纯的抗原不能活化T淋巴细胞，必须经过抗原提呈细胞（APC）摄取、加工和递呈，因为T淋巴细胞活化需要抗原和辅助分子双信号才能有效地诱导CTL形成，发挥抗肿瘤效应。而肿瘤细胞可通过下调肿瘤相关抗原、低表达或不表达MHC分子和共刺激分子，使抗原不能被有效递呈给T细胞以产生特异性的抗肿瘤效应，因此激发有效的T细胞介导的抗肿瘤免疫应答是提高肿瘤免疫治疗效果的关键。负载肿瘤抗原的DC疫苗由于可通过DC表面MHC类分子、共刺激分子将肿瘤相关抗原信息有效地递呈给T细胞，因此作为理想的肿瘤疫苗在实验和临床研究受到广泛重视[10]。

本实验结果显示，肿瘤抗原致敏DC免疫后小鼠可产生肿瘤特异性CTL，从而有效杀伤肿瘤细胞；而单纯肿瘤抗原或未经抗原致敏的DC免疫后小鼠则不能产生足够的具有杀伤肿瘤作用的特异性CTL。经过3周DC疫苗免疫治疗，肿瘤抗原致敏DC治疗组小鼠皮下肿瘤生长得到明显抑制，与PBS对照组比较，差异有显著性。由此推断，DC疫苗治疗乳腺癌是一种有效的方法，有望成为乳腺癌免疫治疗的新方法。

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