C肽对GK大鼠糖尿病肾病的影响

姜永玮，张文健，许世清，成兰云，娄晋宁

近年来，在我国 20 岁以上的人群中，糖尿病的发病率不断上升，糖尿病患病率已经达到9.7%[1]。糖代谢紊乱导致微血管病变，引发一系列并发症，包括肢体缺血坏死、视网膜病变和肾功能衰竭等，是导致糖尿病患者致残和死亡的主要原因。糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，约占住院糖尿病患者的 20%～30%，其中约30%的糖尿病肾病将会发展成为终末期肾功能衰竭。因此，如何防治糖尿病肾病是糖尿病临床治疗面临的重要问题。

糖尿病肾病的主要病理改变包括肾小球基底膜增厚、系膜增生、肾小球足细胞形态改变、肾小球硬化等[2]，而糖尿病肾病的主要功能改变包括 24小时尿蛋白升高，特别是微量白蛋白的升高[3]。虽然口服降糖药或胰岛素治疗能够较好地控制血糖水平，但并不能完全防止或逆转糖尿病肾病的发生或发展。C 肽是胰岛素原转变成胰岛素时切下的一段肽链，与胰岛素等分子释放入血[4]。C 肽本身虽然没有调节血糖的作用，但文献报道，其可以延缓甚至治疗糖尿病动物的糖尿病肾病[5-6]，提示 C 肽可能具有与胰岛素不同的生理作用。为评价 C 肽对糖尿病肾病，特别是对 2 型糖尿病伴糖尿病肾病的治疗作用，我们将灌注有 C 肽的 ALZET 微量渗透压泵放置到伴有糖尿病肾病的自发性糖尿病 GK 大鼠的腹腔内，评价 C 肽对糖尿病肾病大鼠的肾脏功能和肾脏病理的影响，并分析其可能的相关分子机制，为糖尿病肾病防治提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级 8 周龄 GK 大鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司[合格证号：SCXK（沪）2007-0005]；SPF 级 8 周龄雄性 Wistar 大鼠购自北京维通利华实验动物有限公司[合格证号：SCXK（京）2006-0009]。

1.1.2 主要试剂 高脂饲料（普通饲料 88.2%、精炼猪油 10%、胆固醇 1.5%、猪胆盐 0.3%）购自中国科学院实验动物中心；大鼠 C 肽购自美国Sigma 公司；微量渗透压泵（2ML4）购自美国 Alzet公司；BCA 法蛋白测定试剂盒购自碧云天公司；大鼠白蛋白 ELISA 检测试剂盒购自美国 Assaypro公司；兔抗大鼠 FN（Fibronectin）抗血清购自美国Santa Cruz 公司；兔抗大鼠 RAGE（receptor of advanced glycation end products）抗血清和小鼠抗大鼠 PKC-β（protein kinase C-β）单克隆抗体购自美国 Sigma-Aldrich 公司；兔抗大鼠 PKA（protein kinase A）抗血清购自英国 Abcam 公司；RNeasy总 RNA 提取试剂盒购自德国 Qiagen 公司；SYBR green PCR reagent kit 购自日本 Toyobo 公司；ECL 化学发光试剂购自美国 Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 实验动物 SPF 级 8 周龄 GK 大鼠，体重 250～300 g，采用高脂饲料喂养。当 GK 大鼠连续 3 d 血糖 ≥ 16.7mmol/L 时，确认为糖尿病模型建立。成模后的糖尿病 GK 大鼠继续普通饲料喂养 10 周，直至 24 小时尿蛋白达到 300 mg以上，确认为糖尿病肾病动物模型建立成功[3]。SPF级同龄雄性 Wistar 大鼠，体重 250～300 g，用普通饲料喂养相同时间作为正常对照组。

1.2.2 动物分组 将 24 只糖尿病肾病 GK 大鼠用随机数字表法分为3 组，每组 8 只。C 肽治疗组：将灌注了 2 ml C 肽溶液（用 0.9%生理盐水配制）的 ALZET 微量渗透压泵以手术方法植入大鼠腹腔，并于 28 d 后更换一次含有药物的微量渗透压泵。该泵以 50 pmol/(kg·min) 的恒定速率释放 C 肽。空白对照组：腹腔植入灌注 0.9%生理盐水的微量渗透压泵，其他步骤同 C 肽治疗组。胰岛素治疗组：使用甘精胰岛素皮下注射 2.5 IU/d。各组治疗时间均为12 周。另以同龄 Wistar 大鼠饲养 12 周作为正常组。

1.2.3 功能评价

1.2.3.1 血糖检测 治疗前以及治疗后第1、2、3 个月，各组大鼠尾静脉取血测量血糖。

1.2.3.2 尿蛋白和尿白蛋白检测 将各组大鼠置于代谢笼中，收集 24 小时尿液。大鼠尿蛋白检测使用 BCA 法蛋白测定试剂盒，按照说明书测定各组大鼠 24 小时尿蛋白；使用大鼠白蛋白 ELISA检测试剂盒，按照说明书测定各组大鼠 24 小时尿白蛋白。

1.2.4 肾脏病理检查 治疗结束后，将大鼠处死，肾脏经生理盐水灌洗后，部分肾组织用于提取肾小球；部分组织用 10%中性甲醛固定，石蜡包埋后用于 PAS 染色和免疫组织化学染色；部分组织用2.5%戊二醛室温下固定，由北京协和医学院电镜室制作透射电镜标本，在 JEM1010 透射电子显微镜下观察肾小球基底膜（GBM）和足细胞的形态。

1.2.5 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡、脱水，微波热修复，3%过氧化氢溶液封闭内源性过氧化物酶。一抗分别使用兔抗大鼠 FN 抗血清、兔抗大鼠 RAGE 抗血清、小鼠抗大鼠 PKC-β 单克隆抗体、兔抗大鼠 PKA 抗血清，4℃孵育过夜。二抗使用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 抗体或羊抗小鼠 IgG 抗体，37℃孵育 30min。二氨基联苯胺（DAB）显色，苏木素溶液复染、封片后镜检。

1.2.6 实时定量 PCR 治疗结束后，各组大鼠的肾皮质，置于 100 目金属筛网中，用玻璃注射器内芯研磨，收集滤过的细胞悬液，在 4℃条件下，2500×g离心 8min。弃上清，沉淀经 M199 溶液重悬后，过 300 目金属筛网。用 M199 溶液反复冲洗 300 目筛网，收集肾小球，4℃2500×g离心 8min。

使用 RNeasy 总 RNA 提取试剂盒和逆转录试剂盒进行总 RNA 的提取和逆转录。使用 SYBR green PCR reagent kit，应用 ABI PRISM 7300 序列检测系统两步法进行 PCR 扩增。引物序列见表1。2-△△Ct法半定量分析FN、RAGE、PKC-β以及PKA基因 mRNA 水平的变化。

表1 PCR 扩增反应引物及产物Table 1 PCR primers and amplification products

1.2.7 Western blot 提取肾小球总蛋白，采用紫外分光光度法在 280 nm 测定蛋白含量。取 30 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）后，将蛋白转印至 PVDF 膜，用含 5%脱脂奶粉的TBST 室温封闭 2 h，洗膜后分别加入兔抗 FN 抗血清、兔抗 RAGE 抗血清、小鼠抗大鼠 PKC-β 单克隆抗体、兔抗大鼠 PKA 抗血清、小鼠抗 β-actin单克隆抗体，4℃杂交过夜。洗膜后，用辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG 或羊抗小鼠 IgG 进行二抗杂交。使用 ECL 化学发光试剂显色，暗室曝光成像。

1.3 统计学分析

所有数据应用 SPSS13.0 软件进行统计学分析，各组数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为统计学差异非常显著。

2 结果

2.1 C 肽治疗对大鼠血糖及肾脏功能的影响

在治疗期间，正常组大鼠血糖处于正常水平；胰岛素治疗组大鼠血糖维持在（10.24±2.95）mmol/L；而空白对照组和 C 肽治疗组大鼠血糖都持续维持在 16.7mmol/L以上（图1A）。

与正常组比较，空白对照组大鼠的 24 小时尿蛋白和 24 小时尿白蛋白持续升高，而 C肽治疗组大鼠的 24 小时尿蛋白和 24 小时尿白蛋白逐渐降低，从治疗 2 个月开始与空白对照组间统计学差异非常显著（P＜0.01）；胰岛素治疗组大鼠的24 小时尿蛋白和 24 小时白蛋白也呈持续升高趋势，各时间点与空白对照组大鼠相比没有统计学差异，见图1B 和 C。

图1 C肽对大鼠血糖、尿蛋白和尿白蛋白的影响（A：C 肽对大鼠血糖的影响；B：C 肽对大鼠 24 小时尿蛋白的影响；C：C 肽对大鼠 24 小时尿白蛋白的影响。* 与空白对照组大鼠相比，P＜0.01）Figure 1 Effects of C-peptide on blood glucose，urinary protein and urinary albumin of GK rats with diabetic nephropathy.(A:Effects of C-peptide on blood glucose; B: Effects of C-peptide on urinary protein; C: Effects of C-peptide on urinary albumin.*P＜0.01 vs vehicle group)

2.2 C 肽对大鼠肾小球基底膜和足细胞形态的影响

图2 C 肽对糖尿病肾病大鼠肾小球基底膜和足细胞形态的影响电镜图×20 000（A：正常组；B：空白对照组；C：C肽治疗组；D：胰岛素治疗组。* 代表足突融合）Figure 2 Effects of C-peptide on glomerular base membrane (GBM) and morphology microscopy of podocytes in kidney of diabetic GK rat.×20 000 (A: Normal group; B: Vehicle group; C: C-peptide group; D: Insulin group.* represents podocyte foot processes)

与正常大鼠肾小球基底膜相比，空白对照组大鼠基底膜明显增厚，足细胞的足突融合或缺失，排列不规则；C 肽治疗组大鼠的基底膜明显变薄，足细胞的形态和排列明显改善；而胰岛素治疗组大鼠的基底膜和足细胞改变与空白对照组大鼠类似（图2）。

2.3 C 肽对大鼠肾小球硬化的影响

肾脏 PAS 染色结果显示：正常大鼠肾小球毛细血管袢薄而清晰，肾小球囊间隙明显（图3A）；空白对照组大鼠肾小球基底膜明显增厚，系膜细胞增生，毛细血管袢有结节状粉红色的物质沉积，肾小球球囊间隙几乎消失（图3B）；C 肽治疗组大鼠肾小球毛细血管袢比较清晰，肾小球囊间隙明显（图3C）；而胰岛素治疗组肾小球硬化没有明显改善作用（图3D）。

对肾小球 FN 的免疫组织化学染色结果显示：与正常大鼠肾脏（图3E）相比，空白对照组大鼠肾脏染色浓集，肾小球系膜细胞可见棕黄色阳性染色（图3F）；胰岛素治疗组大鼠肾小球阳性染色略有减少（图3H），而 C 肽治疗大鼠肾小球阳性染色明显减少（图3G）；肾小球 FN 的实时定量 PCR（图3I）及 western blot（图3J）检测结果与免疫组化染色结果一致。

图3 C 肽对糖尿病 GK 大鼠肾小球硬化的影响×400（A～D：分别为正常组、空白对照组、C 肽治疗组、胰岛素治疗组大鼠肾脏 PAS 染色；E～H：分别为正常组、空白对照组、C 肽治疗组、胰岛素治疗组大鼠肾脏的 FN 免疫组织化学染色；I：实时定量 PCR 检测大鼠肾小球 FN mRNA 表达；J：Western blot 检测大鼠肾小球 FN 蛋白表达。* 与空白对照组相比，P＜0.01）Figure 3 Effect of C-peptide on glomerulosclerosis in diabetic GK rat.×400 [A - D: PAS (Periodic acid-Schiff) staining of glomeruli in normal group, vehicle group, C-peptide group and insulin group; E - H: Immunohistochemistry staining of FN in normal group, vehicle group, C-peptide group and insulin group; I: Real-time PCR for FN mRNA levels in glomerular lysates; J: Western blot analyses for FN protein in glomerular lysates.*P＜0.01 vs vehicle group]

2.4 C 肽对糖尿病肾病大鼠肾小球 RAGE、PKC-β以及 PKA 表达的影响

实时定量 PCR（图4A）、western blot（图4B）以及免疫组织化学染色（图4C）结果显示：与正常大鼠比较，空白对照组大鼠肾小球 RAGE、PKC-β 在 mRNA 水平、蛋白水平以及组织水平的表达均显著升高（P＜0.01），而 PKA 在 mRNA水平、蛋白水平以及组织水平的表达均显著降低（P＜0.01）；与空白对照组相比，C 肽治疗显著下调糖尿病肾病 GK 大鼠肾小球 RAGE、PKC-β 的表达，升高 PKA 的表达；胰岛素治疗也可以部分降低 RAGE 在肾小球的表达，但是对 PKC-β 以及 PKA 在糖尿病肾病大鼠肾小球的表达水平没有明显的影响。

图4 C 肽治疗 GK 大鼠肾小球 RAGE、PKC-β 以及 PKA 表达的影响×400（A：实时定量 PCR 检测大鼠肾小球RAGE、PKC-β 和 PKA mRNA 表达水平；B：Western blot 检测大鼠肾小球 RAGE、PKC-β 和 PKA 蛋白表达水平；C：免疫组织化学染色检测大鼠肾小球 RAGE、PKC-β 和 PKA 组织表达水平；*与空白对照组大鼠相比，P＜0.01）Figure 4 Effect of C-peptide treatment on the expression of RAGE, PKC-β and PKA in glomeruli.×400 (A: Real-time PCR quantification of RAGE, PKC-β and PKA mRNA levels in glomeruli lysates.B: Western blot analyses of RAGE, PKC-β and PKA protein levels in glomeruli lysates.C: Immunohistochemistry staining of RAGE, PKC-β.and PKA in glomeruli; *P＜0.01 vs vehicle group)

3 讨论

最近研究表明，C 肽是一种生物活性物质，并具有与胰岛素不同的生理作用[7-8]。C 肽治疗能够防止或者延缓糖尿病患者的糖尿病肾病的进展，有效降低肾小球高滤过率以及蛋白尿[5,9-11]。但是 C肽治疗 2 型糖尿病肾病的相关机制尚不明了。

GK 大鼠是一种自发性非肥胖型 2 型糖尿病动物模型，在病程较早期出现糖尿病肾病。我们采用高脂饲料诱发 GK 大鼠血糖升高后，继续饲养10 周，直至出现 24 小时尿蛋白以及 24 小时尿白蛋白明显升高等糖尿病肾病改变后作为本研究的动物模型。

我们将 C 肽灌注微渗泵，放置大鼠腹腔，并通过微渗泵恒定缓慢释放 C 肽，从而评价 C 肽治疗对糖尿病肾病的影响。首先，观察了 C 肽对糖尿病大鼠的血糖，24 小时尿蛋白和 24 小时尿白蛋白的影响。结果显示，C 肽不能降低糖尿病 GK大鼠的血糖，但在治疗 2 个月后可以明显降低24 小时尿蛋白以及 24 小时尿白蛋白，与文献[12]报道结果相一致。蛋白尿是糖尿病肾病的主要表现之一[13]，不仅与糖尿病肾病的肾脏损伤程度密切相关，而且是直接导致肾功能恶化的重要危险因子[14]。因此，C 肽治疗后尿蛋白和尿白蛋白水平的降低，是糖尿病肾病改善的重要指标。

我们进一步研究了大鼠肾小球的病理改变。肾小球滤过屏障由内皮细胞基底膜和足细胞组成[15]，其结构改变是糖尿病肾病发生蛋白尿的病理基础。透射电镜观察显示，糖尿病大鼠肾小球的基底膜明显增厚，足细胞足突融合甚至缺失，而在 C 肽治疗后，肾小球基底膜的厚度减小，足细胞的融合及缺失明显减少。糖尿病肾病的主要病理改变是肾小球硬化和肾小球细胞外基质（ECM）增生，与蛋白尿及肾功能损害有直接关系。PAS 染色结果显示，C 肽治疗能够降低糖尿病 GK 大鼠肾小球硬化程度，并且伴随 FN 表达水平的降低。FN 主要分布于系膜基质中，是构成肾小球 ECM 主要的非胶原糖蛋白，FN 的改变可以充分反映肾小球 ECM 的变化[16]。C 肽治疗可以从 mRNA 水平、蛋白表达水平以及组织水平降低 FN 在糖尿病肾病大鼠肾小球的表达。

最后，我们研究了 C 肽治疗糖尿病肾病可能的分子机制。目前认为，糖尿病糖代谢紊乱产生的糖基化终末产物（AGEs）通过作用于肾小球毛细血管的 RAGE 激活蛋白激酶，从而引发一系列氧化应激反应，导致细胞损伤。细胞内的高血糖是导致细胞内外 AGEs 升高的始动因素[17]，动物实验表明，阻断 RAGE 可以阻止糖尿病肾病的继续进展[18]。AGEs 与 RAGE 结合后，可导致 PKC 的激活，引发氧化应激反应促进糖尿病肾病的进展，包括增加血管内皮细胞损伤和通透性、促进细胞外基质的合成、细胞因子激活等[19]。现已证明，PKC-β亚基在糖尿病肾病发生、发展过程发挥重要作用[20]。小鼠在注射链尿佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导成糖尿病模型后，阻断 PKC-β 亚基，可以逆转STZ 诱导的小鼠糖尿病肾病[21]。PKA 的激活不仅与 PKC 具有交互抑制作用[22]，而且能够降低血管内皮细胞的氧化应激反应[23]，提示 PKA 的激活可能对糖尿病肾病具有保护作用。本研究结果显示，C 肽治疗可以在 mRNA 水平、蛋白水平以及组织水平降低下调 RAGE 在肾小球微血管的表达和PKC-β 亚基表达；恢复 PKA 在肾小球的表达。

另外，我们在实验中发现，胰岛素治疗虽然能够降低糖尿病 GK 大鼠的血糖，但不减少 24 小时尿蛋白和白蛋白。形态学和免疫组织化学染色都显示，胰岛素治疗对糖尿病 GK 大鼠肾小球的病理改变没有明显的改善作用。这一结果提示，外源性的胰岛素由于缺乏 C 肽，对糖尿病肾病没有明显的治疗作用，另一方面，外源性胰岛素的应用可以通过反馈机制抑制内源性胰岛素的产生，导致 C肽水平的进一步降低，对糖尿病肾病产生不利的影响。

综上所述，我们的研究表明：C 肽能够明显改善糖尿病肾病肾小球的微血管病理改变；C 肽可能通过下调肾小球微血管 RAGE 以及 PKC-β 的表达，上调 PKA 的表达从而减少糖尿病肾病大鼠的尿蛋白排泄。

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