高效价冷凝集素对血常规检测结果的影响及消除方法探讨

曾令军 李 莉 吴 庆 黄凤萍 孙余惠 马筱玲

安徽省立医院检验科，安徽 合肥 230001

高效价冷凝集素对血常规检测结果的影响及消除方法探讨

曾令军 李 莉 吴 庆 黄凤萍 孙余惠 马筱玲

安徽省立医院检验科，安徽 合肥 230001

目的 探讨高效价冷凝集对血常规检测结果的影响及消除方法。方法 对有高效价冷凝集素的血常规检标本分别采用未处理直接检测法、37℃水浴法、血浆置换法，利用sysmex XE-2100血细胞分析仪进行检测，并与传统的手工显微镜计数项目WBC、RBC、PLT及血涂片分类结果进行分析比较。结果 有高效价冷凝集素的血常规检标本水浴前、后PLT、Hb、MPV和白细胞分类结果与实际相符，其它多项检测结果与实际不符，尤其是RBC、平均红细胞血红蛋白含量(MCH)、平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)相差十分悬殊，且WBC、RBC、PLT散点图和直方图均明显异常并有相应报警；而置换血浆法除PLT结果偏低外其它检测参数，均与手工显微镜计数项目相符合，散点图和直方图正常，报警消失。结论 对有高效价冷凝集素的血常规标本的检测，无论是未处理直接检测，还是经过37℃水浴后检测，除Hb、MPV、白细胞分类结果与实际吻合外，高效价冷凝集素对多项检测参数有严重干扰；而置换血浆法可以有效排除这些干扰，因置换过程会造成PLT的丢失，故可采用手工计数或者直接上机检测的PLT结果报告。

高效价；冷凝集素；血常规；置换血浆

近年来，随着血液分析仪在各级医院的普及，以其快速、准确等优点得到临床的欢迎。在实际工作中，发现有高效价冷凝集素的血常规检标本，对血液分析仪的检测参数、散点图和直方图有显著干扰作用，导致多项检测参数结果与实际不符。现将我们工作中遇到的2例高效价冷凝集，对血常规检测结果的影响进行分析，并对消除方法进行探讨。

1 资料与方法

1.1 病例资料 某男，76岁。2011年4月8日因肢端青紫、伴有疼痛感就诊。入院前查血常规时发现试管内血液呈果冻样凝块(见图10)，检测结果见表1。冷凝集素效价大于1∶10000，TBi l:37μmol/L,DBi l:17μmol/L,渗透压：328mOsmol/(kg.H2O),诊断为凝集素综合症（CAS），后经治疗症状缓解后出院。 2011年6月9日再次就诊，血常规结果见表2；冷凝集素效价大于1∶2048。再次诊断为凝集素综合症入院。

1.2 仪器与试剂 日本Sysmex公司的XE-2100血细胞分析仪和配套原装试剂、质控物，0.9%生理盐水，100μl德国Eppendor f移液器和吸头，水平离心机，Olympus CX21双目显微镜。仪器使用前已校准，每日测定三个水平配套质控物，结果均在靶值允许范围内再进行日常标本的检测。

1.3 分析方法

1.3.1 血常规分析方法 分为仪器法、显微镜手工计数法以及血涂片的手工分类法。早晨空腹抽取3管2ml静脉血加入EDTA- K2抗凝管中，1管不作处理，在室温（第1次测定室温为28℃，第2次测定室温为32℃）用力振荡后，颠倒混匀8-10次立即直接上机测定，而后显微镜手工计数WBC、RBC、PLT也用该管标本；1管置37℃水浴10min后立即上机测定；1管置换血浆后上机测定。置换血浆法参照张时民[1]和Antiua[2]的富血小板血浆的制备方法：EDTA-K2抗凝标本以160g的力离心6min，用100μl Eppendor f移液器插至上清液与交界面上3mm，缓缓将上层血浆取出弃掉，并记录丢弃的量，再加入等量37℃生理盐水。然后再加入37℃生理盐水3-5ml，以160g的力离心6min洗涤标本3-5次后，缓缓弃掉等体积多加入的生理盐水，标本再颠倒混匀8～10次后上机测定并记录检测参数：WBC、RBC、PLT、Hct、MCV，平均红细胞血红蛋白含量(MCH)，平均红细胞血红蛋白浓度(MCHC)。红细胞体积分布宽度(RDW)，平均血小板体积(MPV)等。白细胞分类分为：中性粒细胞(N)、淋巴细胞(L)、单核细胞(M)、嗜酸性粒细胞(E)、嗜碱性粒细胞(E)。

1.3.2 冷凝集素效价测定 抽取患者不抗凝静脉血2ml，37℃水浴凝固后，迅速分离血清。取血清0.5ml用生理盐水倍比稀释后，加等量用生理盐水洗涤后的3人份混合的5%“O”型红细胞悬液混匀，4℃冰箱中 2-4h后观察结果[3]。

2 结 果

2.1 数据结果 对于有高效价冷凝集素的血常规检标本，由表1、表2在四种不同条件下检测结果可知，与传统的手工分类计数比较，冷凝集素对于血液分析仪的白细胞分类、PLT、MPV、Hb影响不大，符合CLIA'88能力验证计划的分析质量要求[3]；对血液分析仪的WBC结果影响较大，且冷凝集素效价越高影响越大；在直接检测法和37℃水浴法中高效价冷凝集素对RBC、MCV、MCH、MCHC的检测造成严重干扰，且效价越高影响越严重。高效价冷凝集素经37℃水浴法，不能有效消除冷凝集素的干扰，即使水浴10min后肉眼仍能观察到有明显的凝块(见图11)。置换血浆法可以有效排除这些干扰，使除PLT、MCV外所有参数与真值吻合。由于置换过程会造成PLT的丢失，故可采用手工计数或者直接上机检测的PLT结果报告[1]。患者首次就诊置换血浆后MCV高达135f L, 是因为当时患者的渗透压高达328mOsmol/(kg.H2O)，而MCV对溶液渗透压非常敏感[4]，红细胞经等渗透生理盐水置换、洗涤过程涨大所致。因标本呈果冻样凝块，故制备血涂片采用37℃水浴后标本(见图11)和置换血浆后标本分别涂片、使用瑞-姬染色，显微镜下观察计数200个白细胞进行分类(见图12、13)。两种方法制片的白细胞分类结果基本一致，且与用三种上机检测法分类结果一致。

2.2 图形结果

2.2.1 散点图

2.2.1.1 WBC/BASO通道散点图 直接检测法的WBC/BASO通道散点图的左上区域出现许多蓝色的散点(见图1)，是凝集的红细胞造成的；水浴法的该区域散点明显减少(见图2)，置换血浆法该区域散点消失(见图3)，说明水浴法可以减少冷凝集素对WBC/BASO通道的干扰，置换血浆法可以消除冷凝集素对该通道的干扰。

2.2.1.2 IMI通道散点图 直接检测法的IMI通道散点图的对角线方向上方,有明显条带状出蓝色的散点(见图4)，是凝集的红细胞造成的干扰；水浴法的该区域散点明显减少(见图5)，置换血浆法该区域散点消失(见图6)，说明水浴法可以减少冷凝集素对IMI通道的干扰，置换血浆法可以消除冷凝集素对该通道的干扰。

2.2.2 直方图 直接检测法的红细胞直方图左侧多出一个明显的峰，血小板直方图峰顶端略左移(见图7)；水浴法的红细胞直方图左侧多出一个小峰，但高度较低，血小板直方图基本正常(见图8)。置换血浆法红细胞直方图和血小板直方图均正常(见图9)

图1 直接检测法BASO通道；图2 37℃水浴10mi n BASO通道；图3置换血浆法BASO通道；图4直接检测法IMI通道；图5 37℃水浴10min IMI通道；图6 置换血浆法IMI通道；图7 直接检测法直方图；图8 37℃水浴10mi n后直方图；图9 置换血浆法直方图。

2.3 报警提示 直接检测法白细胞报警提示：Blasts、Imm Gran、Lef t shi f t、NRBC.红细胞报警提示：RBC Abn Dst.RBC Lyse resistance.血小板报警提示：PLT Clumps；水浴法报警提示仅有Imm Gran、RBC Lyse resistance、PLT Clumps，其它已消失；置换血浆法各种报警均消失。

3 讨 论

La n d于1 9 1 3年首次对冷凝集素(c o l d agglutinin，CA)进行报道[5]。大多数人血清中都存在CA，但其效价多<1：16，通常不会导致自身血细胞的凝集。当血液温度低于某一特定温度时，循环中自身抗体就会与红细胞抗原相结合。其范围为4～35℃。冷凝集阈温度很少高于30℃，通常低于25℃。文中患者第1、2次就诊时的室温分别为26℃、32℃，血常规标本均出现果冻样凝块属于少见，冷凝集效价极高大于1:2048，与乐家新等在30℃以上一般不发生凝集反应，但较高滴度的冷凝集抗体会导致冷凝集综合征的观点基本一致[6]。孟令章也认为：通常在室温很低的情况下，才会发生的冷凝集现象，在夏天气温较高时也常有发生，这些患者的冷凝集素效价很高，发生凝集的温度范围宽[7]。杨世明等认为冷凝集素的凝集能力随着温度的升高而降低，低效价的冷凝集素在37℃其凝集活性可消失，但高效价的冷凝集素在37℃甚至43℃仍有较强的凝集力[8]。本文探讨的就属于这种情况，其冷凝集素效价高达10000以上，标本即使经过37℃水浴10min后仍导致RBC和HCT结果出现很大偏差，且MCH、MCHC的值与正常参考值极度偏离。

图10 标本呈果冻样凝固；

图11 37℃水浴10min后仍有凝块；

图12 37℃水浴10min后推片；

图13 置换血浆后推片。

实验结果显示，对于高效价冷凝集素标本经37℃水浴法无法有效消除冷凝集素的干扰，即使水浴10min后肉眼仍能观察到明显的凝集块(见图11)。为此我们参照富血小板血浆的制备方法，进行置换血浆。标本以160 g的力离心6 min，离心后分为3层，底部为约占55%体积的红细胞；中间层为占5%体积的血小板浓缩物(platelet concent rate，PC)。顶部为约40%体积的贫血小板血浆(platelet poor plasma，PPP)，主要是纤维蛋白原等血浆成分。用100μl Eppendor f移液器插至上清液与交界面上3mm，缓缓将上层血浆取出弃掉，并记录丢弃的量，再加入等量37℃0.9%生理盐水。然后再加入37℃0.9%生理盐水3-5ml，以160g的力离心6min洗涤标本3-5次后，缓缓弃掉多加入的生理盐水。经过置换血浆后，除因置换过程中造成血小板部分丢失外其它参数与手工法检测的结果基本一致。可见，置换血浆法是有效消除高效价冷凝集干扰血常规检测的好方法。

表1 首次就诊时用四种方法检测有高效价冷凝集素的血常规标本结果

表2 再次就诊时用四种方法检测有高效价冷凝集素的血常规标本结果

直接检测法和水浴法RBC和HCT结果均显著降低， MCH和MCHC结果均显著增高，MCV变化不大。这种现象是由于冷凝集素使红细胞凝集.导致RBC计数降低。因此，HCT(HCT=RBC×MCV)结果仍然降低.并由此造成MCH(MCH=HGB／RBC)、MCHC(MCHC=HGB／HCT)的计算值显著升高。

直接检测法和水浴法白细胞计数结果与手工计数法相比明显偏高，这可能是由于有极高效价冷凝集素的标本，紧密凝集的红细胞，在仪器特定的时间内不能被溶血剂完全溶解。虽Sysmex XE-2100血细胞分析仪在白细胞计数上采用半导体激光流式细胞技术结合核酸荧光染色技术，采用两个通道进行白细胞计数和分类。可有效的排除干扰准确计数分类，但是紧密凝集的红细胞，在仪器特定的时间内不能被溶血剂完全溶解，即便是在溶血能力特别强的WBC/BASO通道中STROMATOLYSER可将绝大多数、甚至有一定抵抗能力的异常红细胞、血小板处理后呈淡影化，但对于紧密凝集的红细胞却无法完全溶解，造成白细胞计数略偏高，并在BASO通道散点图上表现出来(见图1)。

首次就诊时，置换血浆法中MCV为135f L明显大于其它两种检测法，可能是由于患者的血浆渗透压高造成的。红细胞膜是一种选择性滤过膜 ,当血浆渗透压增高 ,红细胞处于相对高渗环境,此时红细胞略微皱缩;而置换血浆用的0.9%生理盐水是一种等渗溶液,它能保持细胞的生物学特性及形态完整性。当高渗血样在置换过程中与0.9%生理盐水接触时,由于渗透压变低红细胞肿胀,红细胞体积增大,造成仪器测定时MCV假性增高[9]。

在进行血常规检测时对于冷凝集现象，有些标本的冷凝集现象肉眼可见，而有的则无法用肉眼观察到，前者如本文中的标本有明显凝块，很容易发现，但对后者如何才能及时发现、识别呢？可以利用下述规律：一般正常人Hb/RBC的比值约为30：1，Hb的单位为g／L，RBC的单位为1012／L[10]。如果血常规结果中Hb/RBC比例较高，比30大很多，且MCH、MCHC的结果异常升高（如本文MCH为196，MCHC为1719）。则提示有可能是冷凝集现象。

综上所述，我们在进行血细胞分析样本时，应仔细观察样本，在审核报告单时，除了重点审查WBC、RBC、Hb主要指标外，千万不要放过MCH、MCHC，尤其是MCHC，往往能帮助我们发现比较严重的错误。另外，有冷凝集现象时在散点图、直方图上也会表现出来，因此，发现散点图、直方图异常时，也应查明原因，排除干扰，防止发出错误的检验报告，影响临床诊断治疗。

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Influence Investigation of High Titer Cold Agglutinin on Hematology Analysis and its Eliminate Measures

ZENG Ling-jun, LI-li, Wu qing，et al.Department of Clinical Laboratory，Anhui Provincial Hospital，Anhui Hefei 230001，China

ObjectiveTo investigate the effect of high titer cold agglutinin on hematology analysis and its eliminate measures.Methods The specimen of the high titer cold agglutinin was tested respectively with 37℃water bath in front and back, and exchange plasma by the Sysmex XE-2100 and the results were analyzed.Results In 37℃water bath in front and back The hematology analyzer can be displayed the most parameters is incorrectness except PLT、Hb、MPV and leukocyte differential count.Particularly, the results of RBC、MCH、MCHC showed significant difference between 37℃water bath in front or back and in fact.The hematology analyzer also can be displayed the abnormal scatter and histogram for WBC、RBC、 PLT and gave corresponding alarm.The other way round, the results of exchange plasma can be displayed the most results is correctness except PLT, The corresponding alarm were disappeared.ConclusionThe specimen of the high titer cold agglutinin has significantly effect on results of sysmex XE-2100 hematology analyzer.In 37℃water bath in front and back can’t eliminate the effect except Hb、MPV and leukocyte differential count.Therefore the suspected cold hemagglutination specimen should be exchange plasma to eliminate the effect and tested again.If the PLT lost more, you can use the result of direct tested.

high titer；cold agglutinin；routine blood test；exchange plasma

R466.111

A

10.3969/j.issn.1009-3257.2011.05.001

曾令军 ,男,主管检验师,主要研究方向为临床医学检验。

2011-06-06