藻蓝蛋白的纯化及功能饮料开发

胡梁斌,王淼焱,李红波,夏松

（河南科技学院,河南新乡453003）

螺旋藻是一种多细胞的丝状蓝藻,含有丰富、均衡的营养成份和多种生理活性物质,是一种绿色功能性食品,具有极高的开发价值[1].藻蓝蛋白是螺旋藻的主要功能成分之一,是其细胞光合作用捕捉光能的辅助色素,也是一个具有生物活性功能的天然蓝色素蛋白,具有类似小牛血清生长因子的功效.从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白不但是一种重要的植物蛋白质资源,而且还将是多种功能食品的重要基料.然而,近年来由于工业废水造成的环境重金属污染,以及水体富营养化造成的有毒蓝藻污染,使螺旋藻原料面临重金属和蓝藻毒素污染风险.

本文针对螺旋藻中藻蓝蛋白进行开发,运用双水相萃取法和等电点沉淀法等对藻蓝蛋白进行纯化,消除重金属和藻毒素污染,获得的高质量藻蓝蛋白原料被进一步开发为功能性饮料.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

螺旋藻片为市售产品；苏打水为食品级；磷酸盐、氯化镉、硝酸、硫酸等均为无机分析纯；微囊藻毒素标准品购于Sigma公司.

1.2 藻蓝蛋白浓度和纯度的测定

取藻蓝蛋白溶液,分别在 280、615、650、750 nm 下测其吸光度,吸光度值分别记为：A280、A615、A650、A750.藻蓝蛋白溶液质量浓度的计算公式[2]如下：

其中：A'615=A615-A750,A'650=A650-A750

藻蓝蛋白溶液纯度的计算公式如下：

1.3 藻毒素测定方法

藻毒素通过HPLC（AglientHPLC1100）检测,采用C18柱（Cosmosil5C18-AR,column 250 mm×4.6 mm,Japan）,柱温控制在 40 ℃,检测波长为 238nm,流动相为 0.05%（V/V）三氟乙酸∶甲醇 =45∶55,流速为 1mL/min.

1.4 含污染物的藻蓝蛋白粗提液制备

将螺旋藻片充分研磨,称取2 g粉末,加入pH=7.2质量浓度为0.01 mol/L的磷酸缓冲液500 mL,在冰浴中超声粉碎10 min,然后以4 000 r/min的速度离心20 min,上清液即为藻蓝蛋白粗提液.向该粗提液中加入微囊藻毒素MC-RR和MC-LR（终浓度均为3.5 μg/mL）,以及氯化镉母液（终浓度为2 μg/mL）.

1.5 藻蓝蛋白的分离纯化

向含污染物的藻蓝蛋白粗提液中添加PEG4000,硫酸钠、氯化钾配置双水相溶液[3],搅拌1 h,移入分液漏斗中,静置过夜后分液.取上层溶液,调节等电点至3.4[4],静置20 min后,以4 000 r/min的速度离心20 min,取沉淀,用pH=7.2质量浓度为0.01 mol/L的磷酸缓冲液定容至25 mL.测藻蓝蛋白提取液的质量浓度和纯度,以及藻毒素和镉的质量浓度.镉通过ICP（电感耦合等离子体发射光谱仪,Optima 2100,PE）测定.

1.6 藻蓝蛋白饮料制备

1.6.1 制备饮料 将上述提纯的藻蓝蛋白溶液,用苏打水稀释至100μg/mL,进行感官评价,评定标准见表1.

表1 藻蓝蛋白饮料的感官评定标准

1.6.2 藻蓝蛋白饮料具体评定

参与评价的人数为10人,参照表1指标进行评价,记录评价结果,通过矩阵计算最后结果.具体评价方法如下：

色泽、组织状态：取50 mL混合均匀的被测样品于洁净的小烧杯中,置于明亮处,用肉眼观察其色泽、透明浊度,检查其有无可见杂质.

风味、口感：被测样品容器开启后,倒入洁净的样品杯中,立即用嗅觉仔细鉴别被测样品的气味；用味觉品尝其滋味,检查有无异味.

模糊综合评判：事物具有多个指标,综合考察各个指标,对该事物做出评价,这就是综合评判问题,应用模糊数学进行综合评判.

质量指标集：u={风味、口感、色泽、均匀程度}

权重向量：a=（0.3 0.3 0.2 0.2）

评语集：v={优秀,良好,一般,差}

2 结果与分析

2.1 藻蓝蛋白的纯化

表2 藻蓝蛋白的纯化

从表2可以看出,经过双水相和等电点沉淀后,藻蓝蛋白的纯度显著提高,为原来的21.9倍.其中双水相萃取的纯化效率最高.但是整个提取过程中,藻蓝蛋白略有损失,在等电点沉淀过程损失最大.

2.2 藻蓝蛋白纯化后镉离子质量浓度变化

所购原料中的镉离子质量浓度含量较低仅为0.001 7 μg/mL,为了能够反映出纯化过程对镉离子的去除效应,我们采用人工添加的方式,添加量为2 μg/mL,使粗提液中的镉离子大幅度超标.然后通过双水相和等电点沉淀后镉离子的质量浓度依然降到与原来相当的水平,仅为0.002 3 μg/mL.

2.3 藻蓝蛋白纯化后藻毒素浓度变化

与镉离子污染类似,为了能够反应出纯化过程对藻毒素的去除效应,采用人工添加的方式,使粗提液中的藻毒素含量大幅度超标（图1）.然而通过双水相和等电点沉淀后藻毒素的含量降到检测线以下.

图1 藻蓝蛋白纯化后藻毒素含量的变化

2.4 藻蓝蛋白饮料评定

通过所制藻蓝蛋白饮料的各项指标进行评分,结果见表3.

表3 饮料评价表

3 讨论

双水相萃取是蛋白质等亲水性大分子非常有效的分离手段[5].在本试验中,它对于藻蓝蛋白的分离纯化起到了重要作用.此外,对于含量较高的组分分离,等电点沉淀也是一种非常高效的分离方法[6].在螺旋藻中,藻蓝蛋白的含量非常丰富,因此,等电点沉淀法适合藻蓝蛋白的分离.通过双水相萃取和等电点沉淀,不仅使藻蓝蛋白的纯度大幅提高,而且还能够有效除掉其中可存在的藻毒素和重金属污染.因此该纯化流程可以应用于藻蓝蛋白的安全性开发.

制得的藻蓝蛋白饮料中藻蓝蛋白的浓度以其发挥最大功能作用时的浓度为准.在该浓度下,藻蓝蛋白的饮料感官评定为良好.其中风味评分较低,是饮料感官品质提升的主要障碍,这是藻蓝蛋白自身的特点所决定的.藻蓝蛋白是卟啉类色素蛋白,具有很高的营养价值和医疗价值,被联合国粮食与农业组织（FAO）誉之为“二十一世纪最理想和最完美的食品”[7].本工艺所加工的饮料风味协调,愉悦清爽,特别是腥味得到较好的去除.但与本饮料所具有的卓越功能相比,其感官性质还有待于进一步改善.

[1]贺玉衡,王世宾.螺旋藻食品在东方的发展[J].食品工业科技,1999,20（6）：9.

[2]杨立红,邹宁,孙东红,等.鱼腥藻藻蓝蛋白的提取[J].食品与发酵工业,2005,31（2）：135-138.

[3]刘杨,王雪青,庞广昌,等.双水相萃取法富集分离螺旋藻藻蓝蛋白的研究[J].海洋科学,2008,32（7）：30-37.

[4]Patil G,Chethana S,Sridevi A S,et al.Method to obtain C-phycocyanin of high purity[J].Journal of Chromatography A,2006,1127（1/2）：76-81.

[5]江咏,李晓玺,李琳,等.双水相萃取技术的研究进展及应用[J].食品工业科技,2007,28（10）：235-238.

[6]王子佳,李红梅,弓爱君,等.蛋白质分离纯化方法研究进展[J].化学与生物工程,2009,26（8）：8-11.

[7]丁玲英.2007中国直销十大产品类别[J].知识经济,2008（1）：91-92.