当归补血汤含药血清对高糖条件下肾小球系膜细胞增殖的影响*

龚 宇 张莹雯

武汉大学中南医院中西医结合科,武汉 430071

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetesmellitus,DM)最严重的慢性微血管并发症之一,其基本病理改变为早期肾小球血管功能异常和肾小球系膜外基质(ex tra cellular m atrix,ECM)进行性积聚,从而导致基底膜(glomerular basementmembrane,GBM)增厚,同时伴有肾小管-间质纤维化和弥漫性肾小球与结节性肾小球肥大、硬化。而肾小球系膜细胞(glom erular mesangial cell,GMC)是肾小球固有细胞中合成ECM最强的细胞,GMC增生、肥大及分泌的ECM进行性积聚是导致肾小球硬化的特殊间质效应细胞,在DN的发病中起关键作用。DN属中医学“消渴”证中的“下消”范畴,多为肝肾亏虚,瘀阻络脉。临床多采用益气养阴、滋补肝肾、生津止渴、活血等中药治疗。本实验通过体外培养的大鼠GMC,研究了当归补血汤含药血清对高糖条件下GMC增殖的影响,以探讨当归补血汤在预防DN发生、发展及DN时蛋白尿的作用,并为临床应用当归补血汤治疗DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

1.1.1 实验动物 50只清洁型SD成年雄性大鼠,体重180～200 g,4～6周龄,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供,合格证号:[SCXK(鄂)2003-00004]。

1.1.2 药材及试剂 当归补血汤(由黄芪、当归组成:5∶1),按要求称取后,水浸泡30 m in后,煎3次,每次煎开10min后过滤取汁,将3次混合,并统一浓缩至2 kg/L药液,由武汉大学中南医院中药房煎制;格列齐特,由湖南千金湘江药业股份有限公司生产,批号:090707;链脲佐菌素(STZ),美国Sigm a公司;M TT溶液,凌飞科技;RPM I-1640培养液,美国Hyclone公司;胎牛血清(fetalbovine serum,FBS),杭州四季青生物工程材料公司提供;超净工作台,苏州净化;37℃5%CO2恒温饱和湿度培养箱,美国Thermo Forma公司;Lambda25紫外分光光度计,美国PE公司;BIO-PROFIL凝胶成像系统,法国Vilber Lov rma公司;Trizol试剂,美国Introgen公司;Genios Plus多功能酶标仪,奥地利TECAN公司;NF-κB一抗兔抗鼠及辣根过氧化物酶标记的二抗羊抗兔多克隆抗体购自美国Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 含药血清的制备 所有大鼠禁食12 h后,其中42只一次性腹腔注射1%STZ 55.0mg/kg(溶于0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,pH 4.2),72 h后取尾静脉血,空腹血糖≥16.7mmol/L者纳入实验,随机分为正常组(NC组,8只)、模型组(HG组,10只)、当归补血汤低剂量组(DHG5组,8只)、当归补血汤中剂量组(DHG10组,8只)、当归补血汤高剂量组(DHG20组,8只)、格列齐特组(GL组,8只)。实验第4日开始,每日定时灌胃,按大鼠与人等效剂量折算方法,GL组给予格列齐特1.5 mg/kg灌胃;DHG20组给予当归补血汤3.6 g/kg灌胃,DHG10组给予当归补血汤2.4 g/kg灌胃,DHG5组给予当归补血汤1.2 g/kg灌胃,NC和HG不给药,每日灌相同容量蒸馏水,1次/d。实验期间自由饮水、进食,不使用胰岛素及其他降糖药物,连续8周,在末次灌胃10 h后麻醉,在无菌条件下经腹主动脉采血,离心取血清,56℃水浴30 m in灭活补体,经过滤除菌,分装冻存备用。

1.2.2 系膜细胞 在无菌条件下取出生3～5 d SD大鼠鼠婴肾,去除肾胞膜,将皮质剪碎后用0.25%胰蛋白酶溶液消化,当细胞分散成单个时,用培养液终止消化,吹匀后接种于含20%的FBS、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素的RPM I-1640培养液中(用Hepes和NaHCO3调pH至7.2～7.4),分瓶后置37℃、5%CO2的饱和湿度的细胞培养箱中培养,至90%汇合时,用0.25%胰蛋白酶溶液消化传代,传代可获得较纯的肾小球系膜细胞。

1.2.3 GMC鉴定 ①倒置显微镜下观察其典型的形态学特征:细胞铺满瓶底;②超微结构观察:透射电镜下GMC呈星形或梭形,胞质内除有少量分布的线粒体、粗面内质网、高尔基复合体外,还有最为特征性的是位于胞膜下和细胞突起向内的微丝结构,核居中央,多呈圆形或卵圆形,核染色质较为稀疏。

1.2.4 实验分组 实验分组NC组(常规培养,仅20%正常大鼠血清)、HG(30 mmol/L D-glucose加10%FBS)、DHG5组(5%当归补血汤含药血清加30 mmol/L D-glucose加10%FBS)、DHG10组(10%当归补血汤含药血清加30 mmo l/L D-glucose加10%FBS)、DHG20组(20%当归补血汤含药血清加30 mm ol/L D-g lucose加10%FBS)及GL组(10%格列齐特含药血清加30mmol/LD-glucose加10%FBS)。

1.2.5 M TT法检测GMC的表达 用0.25%胰蛋白酶消化培养的GMC,再用含20%胎牛血清的RPM I-1640培养液稀释为单个细胞悬液,以×104细胞密度接种于96孔培养板。24 h后细胞完全贴壁展开,用含1%胎牛血清的RPM I-1640培养液24 h同步化细胞,每孔100μl,实验分组同1.2.4,每组浓度设4个复孔,共种3个板(24、48和72 h各一块板),其他条件相同。将培养板移入CO2孵箱中,分别培养到预定时间后,去上清,每孔加入M TT溶液(5 mg/ml,PBS)100μl,37℃避光继续孵育4 h,终止培养。吸去孔内上清液,每孔加入100μl DMSO溶解液振荡10 m in,待结晶物充分溶解后(溶液呈蓝紫色),酶标仪上检测各孔吸光度值(A570)。

1.3 统计学处理

2 结果

在24 h内仅HG组增殖较快(P＜0.05),其余各组间差异无统计学意义(P＞0.05);在一定时间和相应糖浓度的作用下其增殖能力加强(48 h HG组与NC组相比,P＜0.05),随着作用时间的延长和糖浓度的增加,其增殖能力更强(72 h HG组与NG组相比,P＜0.01),说明高糖有促进GMC增殖的作用。另外,不同含量的含药血清对高糖条件下GMC增殖有一定的抑制作用,以DHG20和格列齐特组最为明显(24、48 h与HG组相比,P＜0.05),并呈时间和计量关系(72 h与HG组相比,P＜0.01);而DHG10与HG组相比,仅在72 h有意义(P＜0.05);而DHG5、DHG10与DHG20组在作用的72 h相比,其差异有统计学意义(P＜0.05),两组间差异无统计学意义(P＞0.05),而GL组与DHG20组相比,其差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组24、48和72 h的GMC增殖情况(n=4,±s)

表1 各组24、48和72 h的GMC增殖情况(n=4,±s)

与NC组比较▲P＜0.05,▲▲P＜0.01;与HG组比较△P＜0.05,△△P＜0.01;与DHG20组比较#P＜0.05,##P＜0.01

组别24 h 48 h 72 h NC组1.195±0.074△1.193±0.100△1.252±0.123△△HG组0.839±0.050▲0.779±0.073▲0.589±0.084▲▲DHG 5组0.753±0.069##0.717±0.079##0.690±0.085##DHG 10组0.877±0.051##0.816±0.054##0.769±0.032△#DHG 20组1.189±0.044△1.108±0.047△0.946±0.098△△GL组1.182±0.062△1.087±0.065△0.872±0.047△△

3 讨论

近年来,糖尿病患者迅猛增加,全球现有两亿多糖尿病患者,其中80%的患者生活在发展中国家[1],其发病率呈逐年上升趋势。糖尿病已成为继心血管和肿瘤之后的第三大非传染性疾病[2]。DN是糖尿病最为严重的慢性并发症之一,由DN引发的终末期肾功能衰竭(end-stage renal disease,ESRD)正在成为威胁糖尿病患者生命的主要原因。

DN基本病理特点为肾小球内高压、高灌注、高滤过而出现微量蛋白尿,进而渐进性系膜扩张,GBM增厚和ECM积聚和足细胞的减少而出现大量蛋白尿,最后肾小囊玻璃滴状病变,肾小球毛细血管袢纤维素样或类脂样帽状病变和肾小球弥漫性、结节性硬化[3]。微量清蛋白尿是DN早期临床诊断指标,而大量蛋白尿的出现则预示着肾小球病变不可逆转,DN患者在短期内将进入终末期肾功能衰竭。肾小球滤过屏障是肾小球的重要结构,由内皮细胞、基底膜、足细胞及其裂孔隔膜三层结构所构成,滤过屏障的完整性在阻止蛋白质漏出中起关键作用。GBM作为滤过屏障的重要组成部分在蛋白尿的产生中起重要作用。

实验发现,与正常浓度葡萄糖组比较,随着葡萄糖浓度增加,GMC出现明显增殖时间缩短(P＜0.05或P＜0.01)。而MTT测定结果显示:在相同浓度的葡萄糖作用下,随着作用时间的延长,GMC增殖更加明显(P＜0.01或P＜0.05),说明高糖可以促进GMC增殖,这与Wolf等[4-6]研究结果一致,在高糖(25 mmol/L glucose-DMEM)条件下,S期的GMC百分比明显增加,G0/G1期的细胞百分比明显减少[7]。通过用不同种类、不同浓度的含药血清对不同浓度下的GMC干预后发现,高浓度的当归补血汤含药血清对GMC增殖有较强的抑制作用,这种抑制作用与药物作用时间和浓度呈正相关(在实验的72 h,与NC组相比,DHG5组P＞0.05,DHG 10组P＜0.05,DHG20组P＜0.01),说明在DN条件下,高糖环境、GMC增殖在DN的发生和发展中发挥着重要的作用[8-9],推测抑制GMC增殖能有效的预防和治疗高糖血症诱导的肾脏损伤及DN的发生、发展。

DN属中医学的“肾消”、“下消”、“水肿”、“尿浊”、“关格”、“溺毒”等范畴。病变特点为肝肾阴虚为其本,肺胃燥热为其标,痰、湿、浊、瘀为其因,气血损伤,经络瘀阻为其变,阴阳俱虚、脏腑损伤及水湿潴留为其果。当归补血汤源于金代李呆的《内外伤辨惑论◦暑伤胃气论》,全方由黄芪、当归(5∶1)组成,又名黄芪当归汤、补血汤、芪归汤等,是中国传统的补气兼养血的代表方剂,主治劳倦内伤、气弱血虚、阳浮外越,能增强免疫,调节血液系统及血糖含量,起到保护心血管系统、护肝及抗氧化等作用。现代中药药理研究:当归补血汤能够改善DN大鼠GBM不规则增厚,足细胞排列紊乱且发生融合,肾小管上皮细胞肿胀,大量空泡变性,线粒体体积增大、形态变圆,线粒体嵴脱落;降低血糖、胆固醇、三酰甘油,提高高密度脂蛋白,逆转肾脏肥大,肾重/体重的增加,改善系膜增生,进而减轻ECM积聚和肾脏肥大[10]。还能有效地降低肾小球和肾小管TGF-β1m RNA表达量[11];此外归芪方能改善血糖及脂质代谢紊乱,并能降低尿微量清蛋白及β2-微球蛋白排泄率,缓解肾损伤[12];林为民等和徐宁等[13-14]通过大量的临床观察也证明当归补血汤对DN的明显改善作用。本实验发现当归补血汤可明显抑制GBM的增殖,加强滤过屏障的保护作用,恢复正常的电荷屏障,改善蛋白尿,从而延缓DN的病情进展,保护肾功能。但其抑制高糖条件下GBM增殖的作用机制还须进一步研究。

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