蛹虫草固体培养菌质粗多糖提取与分离工艺研究1)

高宇,程俊文,贺亮,吴学谦﹡ ,李玉,付立忠,胡传久

(1.吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心,长春 130118;2.浙江省林业科学研究院,浙江省森林资源生物与化学利用重点实验室,杭州 310023)

蛹虫草[Cordyceps militaris(L.erFr.)Link]又名北冬虫夏草,北虫草,属子囊菌亚门虫草属。是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目夜蛾科昆虫蛹体上形成的子座与僵死蛹体的结合体。近年研究发现其药用价值和保健价值和冬虫夏草相近[1]。蛹虫草多糖粗提物是蛹虫草重要生物活性物质,具有抗肿瘤、降血糖、抗肝纤维化作用[2]。

大豆含有大量的抗酸性物质,大豆低聚糖、大豆磷脂、大豆多肽、大豆异黄酮等多种功

能性成分。近年来科学研究表明,大豆所含有的功能因子具有较强的抗氧化作用,它可降低血糖和血压,软化血管,增强肌体免疫力,有抗癌、抗衰老的功效[3]。

20世纪90年代至今,液体发酵工程已得到广泛的应用,人们利用液体发酵,除获得菌丝体外,还以获取具有活性的次生代谢产物为目的[4]。但液体发酵由于培养基质富含营养较少,工艺相对简单,导致菌丝体内产生的次生代谢产物较少,且液体发酵由于含水量大易污染造成巨大损失。固体发酵由于含水量少具有不易污染,基质营养成分丰富,节约能源等特点,近些年逐渐得到人们的重视。因此大力发展固体发酵新思维成为眼下的耽误之及。

本实验试将蛹虫草与经过处理的大豆采用固体发酵方法结合,借鉴庄毅固体双向发酵的思路使两种物质产生双向作用从而促进有效活性物质更好的产生[5-6]。本论文主要从多糖方面着手,利用正交试验筛选出此种菌质中多糖提取最佳工艺,检测菌质多糖的抗氧化性,进而分离多糖组分,为后续研究找寻新组分和活性成分提供基础性指导。[7]。

1 材料与方法

1.1 菌质制备

1.1.1 材料

1.1.1.1 菌种。由浙江省林业科学研究院生物技术所提供的蛹虫草菌株CM01。

1.1.1.2 培养基。籽粒饱满的发芽大豆。

1.1.2 方法

1.1.2.1 培养基制备。将液体蛹虫草摇瓶种子液接种在发芽2天经高温高压灭菌后的大豆培养基上10mL,避光恒温培养30天或至菌丝长满培养基,培养温度为25℃。

1.1.2.2 菌质处理。培养好的菌质真空冷冻干燥后,研磨过40目筛,4℃冰箱保存待用。

1.2 菌质粗多糖的提取

1.2.1 菌质多糖的提取

1.2.1.1 正交实验设计。多糖具有很好的水溶性,且超声提取易破坏多糖结构,故采用回流提取法,用蒸馏水来提取,通过单因素实验确定了影响多糖得率的四个因素:提取温度(A)、提取时间(B)、料水比(C)、提取次数(D);然后通过四因素三水平L9(34)正交实验筛选出一个最佳提取组合,因素水平安排见表1。

表1 正交实验因素、水平安排表

1.2.1.2 苯酚-硫酸法测定虫草多糖标准曲线的绘制。精密称取0.1g经过105℃干燥至恒重的分析纯葡萄糖(AR),加水稀释至100mL,摇匀后从中吸取10mL,用蒸馏水定容至250mL,即得浓度为40μ g/mL的葡萄糖母液。从母液中精密量取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,分别用蒸馏水补至 2mL 置于10mL具塞刻度试管中,用旋涡混匀器振匀。分别依次加入6%苯酚溶液1 mL,浓硫酸 5 mL,摇匀放置10min,沸水浴加热15min,冷却至室温,在490nm波长处测定吸光度[8-9],得出线性方程;同时还对该方法的回收率、稳定性、重复性和换算因子F值进行了考察。

1.2.1.3 供试品溶液的制备。首先将待测菌质烘干,精密称取菌质粉末,每份约0.5g,进行3次重复分别按正交表的要求操作;提取后离心,合并上清液,55℃减压浓缩至10mL,95%的乙醇醇沉,样品和乙醇体积比为1︰5,得到的多糖,定容至50mL容量瓶中4℃保存备用。

1.2.1.4 显色反应。精密量取上述供试溶液2mL置于10mL具塞刻度试管中,依次加入6%苯酚溶液lmL,浓硫酸 5 mL,摇匀放置 10min,沸水浴加热15min,冷却至室温,在 490nm波长处测定吸光度,代入线性方程计算百分含量。

1.3 提取粗多糖的抗氧化性测定(DPPH法)

1.3.1 溶液配制

称取3mgDPPH溶于100mL乙醇溶液中,即制成浓度为75μ m/L的DPPH溶液。分别称取粗多糖样品0.0005、0.002、0.004、0.006、0.008g 分别溶于 10mL超纯水中 ,即配制成浓度为 50、200、400 、600、800μ g/mL的待测溶液。

1.3.2 测定方法

移取不同浓度的样品0.3mL置10mL具塞试管中,分别加入0.2mL的乙醇溶液,2.5mL的DPPH溶液混合均匀,放入暗处30min后,在 517nm波长处测定吸光度,根据下列公式计算各样品溶液对DPPH自由基的清除率:◦DPPH清除率=A0-(A-AB)/A0×100%。A为加样品溶液与DPPH溶液的吸光度;A0为不加样品溶液的DPPH溶液的吸光度;AB为不加DPPH溶液的样品溶液。

1.4 粗多糖的分离

1.4.1 样品制备

精密称取粗多糖0.01g置于10mL容量瓶中,蒸馏水定容,所得浓度为10mg/mL的多糖溶液。

1.4.2 色谱条件

色谱柱为:阴离子交换柱 DEAE-Sepharose Fast Flow。洗脱条件为:浓度为0.05mol/L,

pH7.8的Tris-Hcl缓冲液,洗脱条件梯度:0、0.15 、0.25 、0.35 、0.5 、0.75 、1mL 。

2 结果与分析

2.1 回归方程

图1 葡萄糖标准曲线

以吸光值为横坐标(x),以葡萄糖标准溶液体积(mL)为纵坐标(y)得标准曲线。结果表明葡萄糖在0.016～0.072mg/mL呈良好的线形关系,回归方程为:y=2.9981x-0.0243,(R2=0.9947)(如图1)。苯酚-硫酸法测定多糖含量的条件经单因素优化实验而得,经方法学考察此方法操作简便,重复性生好,精密度高。

2.2 多糖提取正交实验结果与分析

对影响多糖提取效果的4个主要因素进行研究,按表1所示的因素水平进行正交实验,分析结果如表2与表3所示。经方差分析得出A因素对多糖的提取影响显著,因素B、C和D则影响不显著,极差分析表明四个因素对多糖影响效果由大到小顺序为:A＞D＞C＞B,由直观分析得出多糖的最佳提取条件为A3B2C2D3,即80℃下,料液比为1︰30,回流提取 2h,提取次数3次。由于提取时间和料液比对多糖提取影响较小,因此为简化实验将实验提取条件定为80℃下,料液比1︰20回流提取1h,提取次数3次。在此条件下进行验证试验,得多糖含量为6.93%。

表2 多糖提取正交实验结果与分析

表3 正交实验方差分析表

2.3 清除DPPH自由基的能力

2.3.1 不同浓度下样品吸光度及DPPH的清除率

不同浓度下的多糖溶液的抗氧化性如表4所示,随着样品溶液浓度的增大,其DPPH的清除率越大,且清除率均在50%以上,比此前报道的有很大程度的提高[10],说明此种发酵菌质粗多糖在抗氧化性上有较明显的作用。

表4 DPPH清除率

2.4 粗多糖的分离结果

收集出峰处溶液,过膜后冷冻干燥得3个多糖蛋白,洗脱结果见图 1。如图所示,59min、85min、218min时各有一个蛋白峰,其中以85min时的峰值最高(图2)。与之相应的3个多糖峰通过苯酚-硫酸法测得。可见此多糖由3种不同结构的单糖组成。单糖结构还有待于我们下一步实验进行分析。

图2 多糖洗脱图

3 讨论

在多糖提取方法的选择中,超声方法虽然简便但因为超声时间若掌握不好会对多糖结构有影响,为保证后续多糖分析实验的精准,本实验选择了回流提取法,回流提取方法虽耗时较长但是操作简便、条件易于控制;而正交实验既包含了单个因素对多糖提取条件的影响,又包含了多个因素间的协同作用,大大减少了实验中的设计组合,因此可以得出,采用回流提取正交实验的方法在多糖提取中既简单又精准。对于提取得到的粗多糖我们进行了抗氧化性的测试,结果比以往的文献报道效果要好的多,说明此种培养基发酵的菌质多糖比液体发酵的菌丝体提出的多糖对DPPH的清除率要高,至于提取出的粗多糖是由几种组分构成的,我们又将提取得到的多糖过阴离子柱后,得到3种不同相对分子质量的多糖蛋白,它们的含量不同,且纯度还需要经电泳、高效液相色谱等方法来鉴定。对于是哪种组分对DPPH的清除起作用这个还未探明。多糖活性与结构之间存在很大的关系,因此今后的实验将主要围绕分析多糖的活性和探明结构与活性的关联来开展。

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[2]柴建萍,白兴荣,谢道燕.蛹虫草主要有效成分及其药理功效[J].云南农业科技,2003,4(1):22-23.

[3]潘紫宵.大豆发芽后营养成分的变化.农产品加工[J].2004(9).

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[6]庄毅.应用药用真菌新型固体发酵工程技术研制中药一类新药的建立[J].中药新药与临床药理,1995,6(4):41.

[7]Ji Young Han,Jintaek Im,Jung Nam Choi,Choong Hwan Lee,Hye Jin Park,Dong Ki Park,Cheol-Heui Yun,Seung Hyun Han SH:Induction of IL-8 expression by Cordyceps militaris grown on germinated soybeans through lipid rafts formation and signaling pathways via ERK and JNK in A549 cells.J Ethnopharmacol,2010,127(1):55-61.

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[9]卜平宇,姜明兰,野生与人工栽培的蛹虫草多糖含量测定[J].中国食用菌,2000,17(2):25-26.

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