尖峰岭野生灵芝和人工栽培灵芝菌丝多糖含量比较

文攀,陈永敢,陈光宙,梁妙芳,林应耀

(琼州学院生物科学与技术学院,海南 五指山 572200)

现代研究表明,灵芝(Ganoderma)具有多种生理活性和药理作用,目前已分离出150余种活性成分,主要有多糖类、核苷类、生物碱类、氨基酸蛋白质类、三萜类和多种微量元素等[1]。其中,灵芝多糖是灵芝新的主要活性成分,它能提高机体免疫力,刺激干扰素的形成,抗病毒,抗氧化,抗肿瘤,提高机体耐缺氧能力,增强肝脏、骨髓、血液合成DNA、RAN和蛋白质的能力,从而延长寿命等多种功能[2-5]。近年来灵芝多糖以其独特的保健功能成为研究的热点。

灵芝多糖含量的多少,已成为衡量灵芝品质的指标之一。目前关于野生灵芝与人工栽培灵芝两者之间多糖含量的研究报道较少。灵芝是有灵芝菌丝经过生长发育而形成的,本研究对野生灵芝和人工栽培灵芝的菌丝多糖含量进行测定比较,探索用人工栽培灵芝替代野生灵芝的可行性,同时也为尖峰岭地区灵芝多糖方面的研究提供相关资料[6]。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

供试材料:野生灵芝(jfl3和jfl5)均由陈光宙老师采自尖峰岭,hz5(从人工栽培基地引种)(以上三种灵芝均由琼州学院生物科学与技术学院林应耀教授鉴定)。各级菌丝、马铃薯、琼脂、木屑、玉米粉、麦麸石膏等培养基材料均从本地购买。

药品和试剂:蒽酮、葡萄糖、95%酒精、浓硫酸。以上药品均为分析纯;实验测定用水均为蒸馏水;培养基配制用水均为双重蒸馏水。

仪器:1810-B型英自动双重纯水蒸馏器,江苏省金坛市恒丰仪器厂;BL-50A型立式压力蒸汽灭菌器,上海博讯实业有限公司医疗设备厂;skfe-01型电热恒温鼓风干燥箱,湖北省黄石市医疗器械厂;B-220型恒温水浴锅,上海亚荣生化仪器厂;800型离心沉淀器,上海手术器械厂;UV-2100型光束紫外可见分光光度计,北京瑞利分析仪器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌丝的制备

1.2.1.1 一级菌丝的制备。一级菌丝的培养基为PDA培养基。具体操作过程为:先取800mL左右水置于锅中煮沸,取200g去皮马铃薯,切成丝状,放入沸水中,煮沸20min,用纱布过滤,去渣,得到马铃薯汁;加入适量水煮融琼脂,并用玻璃棒不断搅拌,且加热温度不宜过高,以免琼脂煮糊。煮融琼脂后,把过滤所得的马铃薯汁加入其中,同时加入所称好的葡萄糖,搅拌均匀,将配好的培养基迅速倒出,定容至1000mL,搅拌均匀后快速分装在玻璃瓶中,以免培养基凝固。1000mL的培养基分装成40瓶。将分装好的培养基拧紧盖子,在121℃,压强为0.1MPa的高压高温灭菌锅中灭菌20min。20min后将培养基取出,放入接种室冷却至室温[7]。

接种时,将经过高压灭菌的工具(解剖刀和镊子)在酒精灯的外焰灼烧消毒、冷却,在酒精灯火焰上方进行接种操作。每种菌丝转接6瓶,并进行3个重复。

1.2.1.2 二级菌丝的制备。当一级菌丝完全覆盖培养基表面时(约15d左右),用来转接至二级培养基中。

二级培养基的配方为:木屑78%+麦麸20%+蔗糖1%+石膏1%+水。本实验需要干料5kg,将配料混匀后分装至玻璃瓶中,每500g干料培养基可以分装至8～10瓶,并在装好培养基的瓶子中央扎孔,拧紧盖,在温度为121℃、压强为0.1MPa的高温高压灭菌锅中灭菌30min。30min后取出,放入接种室冷却至室温。

接种时,将经过高压灭菌的工具(解剖刀和镊子)在酒精灯的火焰上方灼烧消毒、冷却,在酒精灯火焰上方进行接种操作。每种菌丝转接6瓶,并进行3个重复。

1.2.1.3 三级菌丝的制备。当二级培养基中的菌丝长满满瓶时(约25d),用来进行三级种的制备。三级培养基的配方为:木屑73%+玉米粉5%+麦麸20%+蔗糖1%+石膏1%+水。本实验需要5kg干料,将配料混匀后采用袋装的方式分装,分装后扎孔。盖好盖,在温度为121℃、压强为0.1MPa的高温高压灭菌锅中灭菌2h。之后将培养基取出,放入接种室冷却至室温。

接种时,将经过高压灭菌的工具(解剖刀和镊子)在酒精灯的外焰灼烧消毒、冷却,在酒精灯火焰上方进行接种操作。每个菌株的二级菌丝每瓶转接4袋,并做3个重复。

1.2.2 各灵芝菌丝多糖待测液的制备

本试验采用传统的灵芝多糖提取方法:热水浸提法。将培养至生理成熟的各株各级灵芝菌丝(生理成熟的标志是培养基表面出现白色或黄色突起的疙瘩块)挑取出来[8],在65℃的电热恒温鼓风干燥箱烘至恒重。

分别从各菌种一级种的6瓶菌丝中进行挑取,混合后烘干,剪碎混匀并分别称取0.2g,装入试管中,再加入15mL 95%的酒精,盖好试管盖,于78℃的恒温水浴锅中水浴 30min,然后在3000r/min的离心机离心30 min。除去上清液,重复上述操作3次。除去上清液后,在试管中加入15mL蒸馏水,盖好试管盖,在沸水中加热 1h,然后在 3000r/min的离心机中离心30min。收集上清液并定容至100mL,摇匀,得到一级菌丝多糖待测液。

分别从各菌种二级种和三级种的6瓶菌丝进行挑取,然后分别混合并烘干,分别剪碎混匀并称取0.2g,装入试管中,然后,按照上述各菌种一级种菌丝的制作方法分别制取二级菌丝和三级菌丝的待测液。

1.2.3 葡萄糖标准曲线的制作

取适量的葡萄糖在105℃的恒温箱中烘至恒重,取0.5g,用蒸馏水溶解,定容至50mL,从中取出1mL定容至50mL,得到200μ g/mL的葡萄糖溶液[9]。将配制好的葡萄糖溶液按表1取,制备葡萄糖标准溶液。

表1 葡萄糖标准溶液的制取

蒽酮试剂:0.1g蒽酮溶于106mL硫酸溶液中(硫酸溶液的配制为 76mL浓硫酸加30mL水)。现配现用。取6根试管,按表1取葡萄糖溶液和蒸馏水,之后每根试管中加入5mL蒽酮试剂,摇匀,沸水浴10min,再冰水浴10min,在625nm处测定吸光值[10]。

1.2.4 各灵芝菌丝多糖含量的测定

灵芝菌丝多糖含量的测定用蒽酮-硫酸法。蒽酮试剂现配现用。取各菌丝多糖待测液1mL,分别加入蒽酮试剂5mL,在沸水中显色10min,之后立即放入冰水中,冰水浴10min,取出,测定各灵芝菌丝多糖溶液在625nm处的吸光值。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的测定

按1.2.3方法测定吸光值,以葡萄糖浓度(μ g/mL)为横坐标,吸光值(A)为纵坐标,绘制标准曲线,如图1所示,葡萄糖浓度与吸光值线性关系良好。经线性回归,得回归方程为 A=0.0056C+0.0172,R=0.9991。

图1 葡萄糖标准曲线

2.2 灵芝菌丝多糖含量的测定结果

2.2.1 jfl3灵芝菌丝多糖含量的测定结果

由表2可以看出,就每种灵芝菌丝的多糖含量来说,jfl3、jfl5和hz5灵芝一级菌丝的多糖含量分别是2.563%、5.413%和1.92%;二级菌丝的多糖含量分别是0.590%、1.011%和0.571%;三级菌丝的多糖含量分别是0.342%、0.561%和0.531%。一级菌丝的多糖含量最高,二级菌丝的多糖含量次之,三级菌丝的多糖含量最少。就野生种灵芝和人工栽培种灵芝来说,在一级菌丝中野生种(jfl3和jfl5)的多糖含量分别是2.563%和5.413%,而人工栽培种hz5的多糖含量是1.92%,野生种的多糖含量比人工栽培种多3倍;在二级菌丝中,其含量相差最多约2倍,在三级菌丝中,其含量jfl5和hz5相差不多,而且jfl3的多糖含量比hz5少。

表2 各种灵芝各级菌丝多糖含量(%)

将上述测定结果如图2所示:

图2 各级各株灵芝菌丝的多糖含量

从图2中可以看出,野生灵芝和人工栽培灵芝在栽培过程中,各级菌丝的多糖含量均是从多到少。从一级菌丝到二级菌丝,野生种的多糖含量急剧下降,人工栽培种的下降幅度不大。从二级种到三级种菌丝的多糖含量虽有所降低,但变化不大。不同的灵芝中其含量变化也是不同的。

3 结论

从本试验的研究结果可以看出,野生灵芝菌丝的多糖含量比人工栽培灵芝菌丝的多糖含量高,野生灵芝经栽培后菌丝的多糖含量会降低,降低至与人工栽培灵芝菌丝的多糖含量相近。人工栽培灵芝菌丝中是含有多糖的,但含量不高,这与前人所说的野生灵芝的药用价值要高于人工栽培的结果一致[11]。

人工栽培灵芝菌丝多糖含量不高的原因是多方面的,主要与其生长环境不同有关,可能也与灵芝的种源不同有关。

目前,由于对野生灵芝资源的过度开发和市场对灵芝需求量的增加,单靠野生灵芝是不能满足人们对医疗保健的需求的。人工栽培灵芝的菌丝多糖含量虽不及野生灵芝,但也可利用来制取医药和保健品,从而满足人们健康生活的需要。因此,发展人工栽培灵芝是可行的。

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