响应面法优化红树莓色素的纳滤浓缩条件

王金玲，毛凤彪，2，王振宇

（1.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040；2.深圳华大基因研究院，深圳 518083）

树莓（RubusideausL.）为蔷薇科悬钩子属植物，灌木性果树。树莓果实具有很高的营养保健和药用价值，除了富含氨基酸、矿质元素、有机酸和VC、VE等人体必需的营养素外[1]，还含有丰富的红色素，据文献报道，其含量为10～2199mg／100g fw 不等[2－5]。树莓红色素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗病毒、强化免疫系统功能、改善血液循环、降低血压等作用[3－8]；树莓是近年来备受研究者关注的浆果之一，将会成为未来的健康食品。

纳滤（nanofiltration，NF）膜是20世纪80年代末期问世的新型分离膜，它的截留分子量介于反渗透膜和超滤膜之间，约为200～1000；纳滤膜主要依据于筛分效应和电荷效应进行物质分离[9]。近年来，对于纳滤技术应用于果汁的浓缩及活性物质的浓缩，如多糖、肽、黄酮、多酚等[10－12]领域已成功运用，但是应用于天然色素的浓缩纯化，尚未见报道。

东北地区野生树莓资源丰富，近几年又开展了大面积的人工种植，提取并纯化树莓色素，应用于食品工业具有广阔的发展空间。本研究旨在对红树莓果实中提取的色素进行纳滤浓缩纯化，得到纳滤法最佳浓缩工艺，为红树莓色素在食品工业中的应用提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

红树莓鲜果，市售；蒸馏水洗净，滤纸吸去蒸馏水，去除杂物；使用95%乙醇为提取剂，采用提取温度72.4℃，提取时间60min，料液比为1∶8.5，pH为2.0的条件提取。将提取液进行纱布过滤后抽滤，除去沉淀，测得树莓提取原液花色苷质量浓度为12.22mg／mL，4℃保存备用。试验中所用其它试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器设备

YP2001N 电子天平、PHS-25 数显 pH 计、TU-1810紫外可见分光光度计均为上海精密科学仪器有限公司产品；DK-98-1电热恒温水浴锅：天津市泰斯特仪器有限公司；纳滤膜分离装置：膜截留分子量为300道尔顿，上海摩速科学器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 单因素试验

选取对纳滤有较大影响的因子进行单因素试验以确定各因素的取值范围。这些因素为：纳滤温度、压力、色素溶液pH、进料质量浓度（以树莓提取原液浓度为100%）。恒定进料体积和纳滤时间，在其他因子固定的情况下变化待测定因子，测定纳滤前后色素溶液的吸光度。单因素试验选取的因子及水平见表1。

具体操作方法如下：初始纳滤条件为纳滤温度20℃，压力0.6MPa，色素溶液pH 为3，质量浓度100%，进料体积为550mL，纳滤时间为15min，纳滤方式为不加水循环式。

1.3.2 响应面设计

通过上述单因素试验所得的结果，响应面试验设计[13]选取单因素所研究的进料质量浓度、pH、温度、压力四个因素，设定三个水平，优化最佳的纳滤工艺参数，每个试验重复3次。

1.4 浓缩度和截留率的计算

浓缩度（浓缩比）＝A2／A1

截留率（回收率）＝（A2×V2）／（A1×V1）×100%

A1为纳滤前色素溶液吸光度，A2为纳滤后色素溶液吸光度，V1为纳滤前色素溶液体积，V2为纳滤后色素溶液体积；A2、A1在相同的pH下测定，吸收光波长为514nm。

1.5 数据处理与分析

数据采用sas 9.0分析及处理。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 红树莓色素纳滤浓缩的单因素结果

单因素试验结果表明（图1），红树莓色素纳滤纯化单因素中，最佳纳滤温度为30℃；纳滤膜工作压力为0.6或0.7MPa时，纳滤效果较好，鉴于纳滤装置的最大工作压力为0.7MPa，选取0.6MPa为纳滤压力；最佳质量浓度为80%；最佳色素溶液pH为2.5。

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 部分因子试验结果

表2 部分因子设计编码值及水平

表3 部分因子试验设计及结果

为了快速从多个影响因子中找到对纳滤效果影响最大的因子，以单因素试验中获得的最佳值为基础，将各因子的最佳值确定为中心值，并进行适当的扩充而成为自变量的取值范围，以响应面方法优化纳滤浓缩纯化红树莓色素的最佳条件；设计部分因子试验，各因子编码值见表2，试验设计和结果见表3，分析结果见表4和表5。

对部分因子试验结果进行回归分析表明（表4），pH（X1）和质量浓度（X3）对纳滤膜浓缩纯化树莓色素在99%和95%的水平上有显著的影响，而温度（X2）和压力（X4）对纳滤效果的影响不显著，各因子间没有交互作用。由回归分析结果可得一次拟合线性回归方程：

对方程进行方差分析（表 5），F＝5.04，P＝0.0080，说明模型在概率α＝0.01水平上足够显著拟合试验数据。

对试验数据平均值与中心点试验数据的平均值进行t－检验，t－检验结果表明，在方差相等和方差不等的条件下，中心试验点平均值和部分重复试验平均值差异不显著（P＝0.7104），说明试验的中心点（浓缩度值最大）不在当前试验的设计范围之内，需应用最陡爬坡法寻找试验的最优空间。

表4 部分因子试验回归分析表

表5 部分因子试验模型方差分析表

2.2.2 最陡爬坡试验

FFD的检验数据显示，温度（X2）和压力（X4）对纳滤效果的影响不显著，因此固定在零水平。pH（X1）和质量浓度（X3）对纳滤膜浓缩纯化树莓色素具有显著的影响，且X1、X3的系数为正，说明升高pH（X1）和质量浓度（X3）对纳滤效果的影响效应为正。以pH（X1）和质量浓度（X3）的中心值为基准，pH以每次升高0.3为基本步长，质量浓度的基本升高步长为4，进行最陡爬坡试验。试验设计与结果见表6。

表6 最陡爬坡试验

表6列出了pH和质量浓度改变的方向，即pH每次升高0.3，质量浓度每次升高4。从表中可以看出，pH3.1，质量浓度88，所对应的浓缩度（Y）达到最大为2.094，随后浓缩度值开始下降，所以pH3.1、质量浓度88% 可用作下面优化试验的中心点。

2.2.3 中心组合试验设计及响应面分析

从上述最陡爬坡试验可以看出，响应变量Y值已接近最大响应区域。纳滤膜浓缩纯化树莓色素的优化可以利用中心组合设计对两个独立的过程变量进行优化，即对pH和质量浓度进行中心组合设计。试验设计及结果见表7和表8，数据分析见表9和表10。从表9和表10中分析结果可知，该模型在86.55%概率水平上回归显著，因而模型是可行的。该模型的线形项在95%的概率水平上是显著的，平方项在99%的概率水平上非常显著，各因素之间没有交互作用。从对试验数据进行多项式回归，可以得到如下二次多项式方程：

方程中平方项的系数均为负值，方程表征的抛物面开口向下（见图2），有极大值点。因此方程给纳滤膜浓缩纯化树莓色素提供了一个较合适的模型。

表7 中心组合试验因子及水平

表8 中心组合试验结果

表9 中心组合试验回归分析结果

从分析结果还可知，质量浓度变化对纳滤效果影响非常显著，对方程 （2）求导，可以得到模型的极大值处，pH和质量浓度两因子编码值分别为：0.125096（X1）和0.191131（X2），实际值分别为：pH3.12和质量浓度89.53%，此时树莓提取液中花色苷质量浓度为10.94mg／mL。此时模型预测的最大响应值即浓缩度为2.2993。为了证实模型的预测值与实测值之间的拟合程度，在上述2因子的取值处进行验证试验，其响应量结果为2.282±0.066（N＝3，P＝95%），预测值与试验值之间具有良好的拟合性，表明了模型的有效性。

表10 中心组合试验方差分析

经响应面分析获得的纳滤膜浓缩纯化树莓色素的优化条件如下：温度为30℃、压力为0.6MPa、进料花色苷质量浓度为10.94mg／L、pH 为3.12。

在最佳条件下纳滤树莓色素溶液，截留率为98.26%，色素溶液的花色苷质量浓度由10.94mg／L提高到38.24mg／L。由此可见，截留分子量为300道尔顿的纳滤膜对树莓色素的截留效果很好，具有良好的浓缩和纯化作用。

pH和进料质量浓度对纳滤效果影响的响应面图如图2所示。

图2 pH和进料质量浓度对纳滤效果影响的响应面图

2.3 红树莓色素纳滤浓缩动态试验

为了研究纳滤效果随时间的变化，设计小型动态试验，试验结果如图3所示。动态试验的进料体积为1500mL，纳滤时间为33min，每3min测1次截留液的吸光度，并计算浓缩度。纳滤条件为：温度30℃，压力0.6MPa，pH3.12，进料花色苷质量浓度为10.94mg／L。

图3 纳滤浓缩动态试验

由图3可知，浓缩度随纳滤时间的延长逐渐增大，进料体积为1500mL时，纳滤30min浓缩度为3.981，接近最大值3.996。而且通过试验得知，由于纳滤过程采用的是不加水循环方式，进料体积直接影响纳滤时间的长短，从而影响纳滤效果。

3 讨论与结论

3.1 讨论

通过本研究可见，纳滤对红树莓色素具有很好的浓缩纯化效果。红树莓色素属于花色苷类物质，对温度及pH等条件变化均比较敏感，这使得此类色素在提取后加工过程中会遇到一些稳定性问题，而纳滤工艺条件均能满足利于花色苷色素稳定的条件，所以纳滤是花色苷类色素很好的浓缩方法。

很多学者在研究纳滤方法的应用方面，采用膜通量来衡量纳滤效果[14－16]，而本研究中采用浓缩度衡量红树莓色素纳滤浓缩效果，是基于以下两点考虑。其一，本试验重点研究纳滤能否成功运用于红树莓色素乃至花色苷类色素的浓缩纯化，而非考察膜的工作性质；其二，随着纳滤的进行，膜通量随纳滤时间延长而下降，同时，有少量花色苷会透过纳滤膜，导致膜通量不能很好的反映浓缩的效果。本研究在以浓缩度为指标考察纳滤效果的同时，考察了膜对红树莓色素截留率，发现，截留率在95%～98%区间，也说明纳滤膜可以很好的对红树莓色素进行浓缩纯化。

纳滤是一个动态过程，本研究中采用不加水循环式纳滤，料液的体积大小直接影响到纳滤的效果，料液体积大，达到相同的浓缩效果，需要的时间则长；同时随着纳滤的进行，膜开始污染，膜通量下降，纳滤浓缩的效果会受到一定的影响，因此，在纳滤运用到花色苷类色素浓缩纯化的具体应用时，还应该考虑到料液体积及膜的清洁程度等因素的影响。

3.2 结论

红树莓色素纳滤浓缩纯化法的最佳工艺条件为，纳滤温度为30℃，压力为0.6MPa，进料花色苷质量浓度为 10.94mg／L，pH 为 3.12。色 素 截 留 率 为98.26%。动态试验表明，红树莓色素纳滤浓缩度可达3.996。纳滤法浓缩纯化为红树莓色素提取后加工提供了便捷稳定可行的方法。

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