小鼠腹水型肝癌高低转移细胞株DARS2蛋白表达的差异

吴学标，胡 军，宋 阳，宫琳琳

(大连医科大学 组织胚胎学教研室，辽宁 大连 116044)

DARS2蛋白，即线粒体天冬氨酰-tRNA 合成酶2(AspRS2)是Scheper GC 等2007年确定的，与脑干脊髓白质病变及乳糖增高症相关[1]，与肿瘤的相关性尚未见报道。本实验研究DARS2蛋白在具有高、低淋巴道转移潜能的小鼠腹水型肝癌细胞株Hca-F、Hca-P中的表达差异，以期发现新的肝癌转移相关蛋白。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验对象：具有高、低淋巴道转移潜能的小鼠腹水型肝癌细胞株Hca-F、Hca-P，由大连医科大学病理教研室筛选提供，本实验室长期冻存。

1.1.2 主要试剂：胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)，RPMI 1640培养基(Gibcobrl公司)，ECL试剂盒(Amersham Biosciences公司)，PVDF膜(Pall公司)，兔抗小鼠DARS2多克隆抗体(Protein Tech Group公司)，羊抗兔IgG(Santa公司)，免疫组化染色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)，浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养：复苏冻存的细胞，分别将Hca-F，Hca-P细胞接种615小鼠腹腔，7 d无菌条件下抽取腹水，以PBS缓冲液洗涤1次，将细胞培养在含10%的胎牛血清，RPMI 1640培养基中(含青霉素100 μg/mL，链霉素100 μg/mL)，在37 ℃、饱和湿度及5% CO2的培养箱中培养24 h，使巨噬细胞贴壁，收集未贴壁细胞即Hca-F细胞、Hca-P细胞备用。

1.2.2 免疫印迹分析：分别提取Hca-F细胞及Hca-P细胞的总蛋白；取上清液倍比稀释，用考马斯亮蓝染色，于波长595 nm处测吸光度。分别将相同含量的蛋白样品和上样缓冲液以体积比1∶1的比例混合，水中煮沸5 min，使蛋白质变性，以每孔30 μg的蛋白含量点样，经10%SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉4 ℃封闭过夜，分别加DARS2一抗(1∶500)室温摇床孵育3 h，用TBS缓冲液洗4次，10 min/次，加入二抗(1∶1000)室温摇床孵育2 h，再用TBS缓冲液洗涤3次，10 min/次。加入发光试剂(ECL)显色。以β-actin作内参照。用图像分析软件计算出每个蛋白条带的积分光密度；计算出目的条带积分光密度/对应内参条带积分光密度的比值，该值即可反映对应样品内目的蛋白的相对含量。

1.2.3 免疫细胞化学实验：分别离心收集Hca-F细胞及Hca-P细胞，制成细胞涂片，入80 ℃烘箱中烤片3 h；纯丙酮固定20 min；0.1%Tritou X-100孵育30 min；H2O2孵育15 min；正常动物血清封闭10 min；滴加一抗，湿盒中4 ℃孵育过夜；PBS洗3次；滴加二抗，室温孵育20 min。以上各步骤间均以PBS洗3次。DAB显色，苏木精复染细胞核，脱水、透明、封片，显微镜下观察结果并拍照。阳性表达可见棕黄色沉淀物。

1.3 统计学方法

所有实验结果均来自至少3组平行或3次重复实验。数据由SPSS 10.0软件进行统计学分析。本实验所涉及的两组实验数据比较采用t检验分析，数值用 mean±SD 表示，P<0.05为差异有显著性意义。

2 结 果

2. 1 免疫印迹分析细胞中DARS2蛋白的表达

经免疫印迹分析检测DARS2蛋白的表达情况。通过图像分析软件对蛋白条带进行灰度值分析，与β-actin内参照相比，DARS2蛋白的相对含量在小鼠腹水型肝癌高转移细胞株Hca-F中的表达中仅为0.219±0.016，明显低于低转移细胞株Hca-P 细胞的0.473±0.043(图1)。差异有显著性意义(P=0.01)。

图1 免疫印迹分析DARS2蛋白表达

2.2 免疫细胞化学方法检测细胞中DARS2蛋白的表达

经免疫细胞化学方法进一步检测DARS2蛋白的表达情况。结果显示DARS2蛋白在小鼠腹水型肝癌高转移细胞株Hca-F及低转移细胞株Hca-P 细胞中均有表达，但在高转移细胞株Hca-F细胞中表达较少；在低转移细胞株Hca-P细胞中表达较多，表达主要定位于细胞质中，显示较强的棕黄色沉淀物(图2)。结果与免疫印迹分析一致，进一步证实了DARS2蛋白在小鼠腹水型肝癌高转移细胞株Hca-F中的表达明显低于低转移细胞株Hca-P 细胞。

3 讨 论

线粒体是细胞能量代谢中心。若线粒体受到损伤，则会影响整个细胞的正常功能。近年，线粒体与肿瘤之间的联系已引起了专家学者的普遍关注。国内外已在乳腺、肺、胃、肝、胰、结肠、肾、膀胱、前列腺、甲状腺和卵巢等处的恶性肿瘤中都发现了线粒体DNA突变。

最近的研究结果表明，线粒体内的蛋白质翻译机器的组成成分——氨基酰-tRNA 合成酶(aminoacyl-tRNAsynthetase，AARS)与人类的疾病密切相关。AARS是一类古老的蛋白质家族，能催化tRNA 的氨基酰化反应，生成氨基酰，为蛋白质生物合成提供原料[2]。目前，已有研究表明人线粒体天冬氨酰-tRNA 合成酶(AspRS)基因上的一系列突变可导致其 mRNA 被快速降解或者蛋白质氨基酸一级结构发生改变，引起脑干脊髓白质病变及乳糖增高症。研究者首先根据微卫星标记构建了来自30 个家庭的38 个患者的遗传图谱，在1 号染色体的一段特定区域发现了潜在的致病基因。对这一区域进行DNA 测序，发现了致病基因DARS2。DARS2位于染色体1q25.1，广泛存在于睾丸、脑、未知功能组织、胚胎组织、胰脏、眼睛、肾脏、胎盘、前列腺、脾脏、肌肉、皮肤、肝、乳腺、子宫、卵巢、脂肪组织、淋巴结、膀胱、垂体、口、气管、胃、肠、咽喉、肺、结缔组织、唾液腺、腹水、胸腺、血管、神经、骨、骨髓、心脏等组织。该基因编码线粒体AspRS，负责线粒体基因组遗传密码的解析。在这些患者的DARS2 中发现了一系列不同的点突变，包括无义突变、错义突变和内含子序列突变。但是，健康个体的对照组(400～420个)的DARS2 中却没有任何突变，证实了DARS2基因的致病性[1-2]。随后，有研究者相继在DARS2中发现新的点突变，并证实DARS2基因突变可以作为脑干脊髓白质病变的诊断指标之一[3-7]。

图2 免疫细胞化学方法检测DARS2蛋白的表达 ×400

本研究以小鼠腹水型肝癌高、低转移细胞株Hca-F和Hca-P为细胞模型，探讨DARS2蛋白在这一对细胞株中的表达是否具有差异性。本实验采用的动物模型为615型小鼠，因为在一般的小鼠中腹水型肝癌细胞并不能很好地增殖表达。Hca-F和Hca-P细胞是由腹水型肝癌细胞H22中筛选出的特异性淋巴道转移的高低转移株。其中，Hca-F细胞为高转移株，Hca-P细胞为低转移株，两株细胞具有高度的同源性，是研究肿瘤转移机理的较好模型。本实验免疫印迹分析及免疫细胞化学方法检测结果均显示DARS2蛋白在腹水型肝癌高转移细胞株Hca-F中的表达明显低于低转移细胞株Hca-P细胞；表达主要定位于细胞质中。结果提示，DARS2蛋白的表达降低可能与肝癌细胞转移能力增强相关。DARS2可能由于发生了点突变而使DARS2蛋白的表达降低，进而使线粒体受到损伤，影响了细胞的生物学功能，提高了细胞的侵袭、迁移能力。DARS2与肿瘤的相关性目前尚未见报道，还有待于进一步的实验研究。

参考文献：

[1] Scheper GC, van der Klok T, van Andel R J, et al. Mitochondrial aspartyl-tRNA synthetase deficiency causes leukoencephalopathy with brain sten and spinal cord involvement and lactate elevation[J]. Nat Genet, 2007, 39(4):534-539.

[2] 周小龙, 王恩多.与人类疾病相关的几种线粒体氨基酰-tRNA合成酶. 生物化学与细胞物理学进展[J]. 2008, 35(8):853-858.

[3] Uluc K, Baskan O, Yildirim KA, et al. Leukoencephalopathy with brain stem and spinal cord involvement and high lactate: a genetically proven case with distinct MRI findings[J]. J Neurol Sci, 2008, 273(1-2):118-122.

[4] Sharma S, Sankhyan N, Kumar A, et al. Leukoencephalopathy with brain stem and spinal cord involvement and high lactate: a genetically proven case without elevated white matter lactate[J]. J Child Neurol, 2011, 26(6):773-776.

[5] Orcesi S, La Piana R, Uggetti C, et al. Spinal cord calcification in an arly-onset progressive leukoencephalopathy[J]. J Child Neurol, 2011, 26(7):876-880.

[6] Lin J, Chiconelli Faria E, Da Rocha AJ,et al. Leukoencephalopathy with brainstem and spinal cord involvement and normal lactate: a new mutation in the DARS2 gene[J]. J Child Neurol, 2010, 25(11):1425-1428.

[7] Isohanni P, Linnankivi T, Buzkova J, et al. DARS2 mutations in mitochondrial leucoencephalopathy and multiple sclerosis[J]. J Med Genet, 2010, 47(1):66-70.