三磷甲苯磷酸酯暴露对鸡脊髓神经中髓鞘碱性蛋白表达的影响

韩雪榕，朴丰源

(大连医科大学 劳动卫生与环境卫生学教研室，辽宁 大连 116044)

一些有机磷化合物(organophosphorus compounds,OPs)可诱导人及敏感动物产生迟发性神经毒性症状(organophosphorus ester-induced delayed neuropathy,OPIDN)。该病以周围神经及脊髓长束的轴索变性、继发脱髓鞘为病理特征，临床主要表现为四肢远端麻木，痛觉过敏，运动失调和行走困难，甚至瘫痪[1]。髓鞘是神经元突起的电绝缘物质，能保证神经信号传导的准确性。缺乏髓鞘可延缓神经传导，使邻近突起间的冲动异常，进而影响神经-骨骼肌接头处兴奋传递，最终失去对肌肉的控制[2]。已知髓鞘是由少突胶质细胞等神经支持细胞所形成，即由髓鞘细胞的细胞膜包裹在神经细胞轴突外面的细胞膜组成。因此，髓鞘的营养与维持主要与髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein，MBP)、髓鞘相关糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(myelin oligodendycyte glycoprotein,MOG)等膜蛋白质密切相关。

作者前期研究发现苯甲基磺酰氟(phenylmethanesul fonyl fluoride,PMSF)只对OPs诱发的OPIDN有拮抗作用，但对OPs诱发的急性毒性却无保护作用[3]。根据上述发现，本研究利用双向电泳和质谱分析技术，在经典诱发剂三磷甲苯磷酸酯(tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP)暴露鸡腰髓组织中筛查出可能与脱髓鞘相关的差异表达蛋白MBP，并为探讨OPIDN模型中脱髓鞘的原因提供依据。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂

TOCP的化学纯度为99%以上，购自日本关东化学公司；电泳试剂、质谱分析试剂及显色试剂均由Sigma公司生产；其它试剂均为国产或进口分析纯试剂。

1.2 动物处理

罗曼鹤母鸡48 只，10月龄，体重1.5～2.0 kg，由大连市韩伟养鸡场提供。在作者前期的实验中发现，经口一次给予1000 mg/kg TOCP可100%诱发鸡的OPIDN，皮下先给40 mg/kg PMSF后可完全防止TOCP诱发的OPIDN。根据预实验结果，将罗曼鹤母鸡48只随机分成染毒组(1000 mg/kg TOCP)、PMSF前干预组(在染毒之前给予40 mg/kg PMSF)和对照组(生理盐水0.6 mL/kg)，每组16只。染毒后第5天和第20天分别每组处死8 只动物，低温环境下分离腰髓，在-80℃冰箱保存备用。

1.3 蛋白质的双向电泳分析

电泳上样为100 μg蛋白，第一向使用IPGphor IEF System 等电聚焦仪，18 cm pH 3～10的干胶条，按仪器说明书操作;第二向采用12%的分离胶，跑完电泳后对胶条银染法染色。利用瑞典Amersham pharmacia Biotech公司生产的双向凝胶专用透射扫描仪高精度扫描凝胶。蛋白点采用2-DE图像分析软件Image Master 2D Platinum 5.0进行图像分析，蛋白表达差异在2倍以上、0.5倍以下的视为结果差异具有显著性意义。

1.4 质谱鉴定

通过2-DE图像分析软件Image Master 2D Platinum5.0进行双向电泳图像分析筛选与对照组比较，TOCP组差异表达有显著性意义，且在PMSF前干预组表达差异无显著性意义的蛋白匹配点，作为可能与脱髓鞘相关的差异表达蛋白点进行质谱鉴定。即从凝胶上切下这些蛋白点，依次脱色、还原、烷基化、冻干酶解后，将制备好的样品进行点样和质谱分析，获得肽质量指纹图谱。通过数据库检索分析，确定蛋白质性质。肽指纹图谱允许误差0.3D,相对分子质量允许误差±20%。

2 结 果

2.1 鸡腰髓组织蛋白双向电泳扫描图的差异

根据PMSF的作用特点，利用双向电泳扫描图选择与对照组比较在TOCP组差异表达有显著性意义，且在PMSF前干预组差异无显著性意义的蛋白匹配点，作为与OPIDN相关蛋白点。据此对双向电泳结果图谱进行背景消减，斑点检测、匹配及斑点位置进行重复性分析，见图1、2。

2.2 质谱鉴定结果

对上述筛选的蛋白点做Maldi-Tof 鉴定，用data explorer TM 显示 PMF 然后进行基线调整，去除干扰峰、滤过核素峰和提取肽质量数据到Swiss-por 进行查询，得到可能与脱髓鞘相关的差异表达蛋白为MBP。该蛋白点的肽质量指纹图(PMF)见图3。 且在质谱分析中发现该蛋白氨基酸数目为174，等电点为4.10838，相对分子量为18797，得知该蛋白为MBP。

图1 染毒第5天鸡腰髓组织MBP双向电泳扫描图

图中红框所示为染毒第5天，各组鸡腰髓组织髓鞘碱性蛋白(MBP)差异表达点的双向电泳扫描图

图2 染毒第20天鸡腰髓组织MBP双向电泳扫描图

图中红框所示为染毒第20天，各组鸡腰髓组织髓鞘碱性蛋白(MBP)差异表达点的双向电泳扫描图

图3 MBP肽质量指纹图谱

2.3 TOCP暴露对MBP表达影响

如图4所示，在染毒第5天时，TOCP组和PMSF前干预组与对照组比较，MBP变化差异均无显著性意义；在第20天时， TOCP组与对照组的MBP表达比值为0.3667，其表达下调达2.7倍，差异有显著性意义(比值<0.5)。然而，PMSF前干预组与对照组的MBP表达比值只有0.7601，差异无显著性意义(比值在0.5～2之间无意义)。

图4 TOCP暴露第5、20天各组鸡腰髓神经组织中MBP表达比较

3 讨 论

Nanda等[4]研究表明，TOCP染毒后鸡的神经组织呈现典型的退行性形态学改变，即脱髓鞘是OPIDN诱发动物神经组织超微结构的重要特征，病变呈进行性发展，且有明显的剂量和时间依赖性。自1962年首次从豚鼠脑中分离出一种含有大量的碱性氨基酸的强碱性膜蛋白MBP后,国内外学者对其大量研究发现，髓鞘膜相关蛋白MBP是维持和营养髓鞘，并保证其结构完整和功能正常运行的重要蛋白[5]。然而，在OPIDN动物模型的神经组织中被检测出髓鞘膜相关蛋白异常表达的资料尚未见报道。

在本研究中，在染毒第5天和20天，通过双向电泳技术从TOCP暴露组的鸡脊髓神经组织中筛选出与对照组比较表达差异有显著性意义，且与PMSF前干预组无显著性差异的相应蛋白匹配点，再通过质谱分析进行蛋白质定性，并从中筛选与脱髓鞘相关的差异表达蛋白。染毒第20天的结果表明，TOCP组与对照组的MBP表达比值为0.3667，其表达下调达2.7倍，差异有显著性意义(比值<0.5)。然而，PMSF前干预组与对照组的MBP表达比值只有0.7601，差异无显著性意义(比值在0.5～2之间无意义)。这一结果表明，TOCP在其暴露后期具有下调MBP表达的作用。MBP是中枢神经系统髓鞘由少突胶质细胞所分泌的特有蛋白,约占髓鞘蛋白总量30%,是与酸性脂质结合成髓鞘的基本成分，形成稳定的膜状板层结构，具有屏蔽、支持、营养髓鞘等作用[6]。上述文献和本研究的结果提示，TOCP诱导MBP表达下调与长轴神经纤维脱髓鞘可能有密切关联。另有文献报道，当神经系统病变累及髓鞘时MBP可释放入脑脊液和血清中[7，8]，认为MBP可作为脱髓鞘相关疾病的生物学诊断指标。因此，今后有必要进一步证实OPIDN动物模型中MBP在脑脊液和血清的浓度变化，从而为寻找迟发型神经毒性疾病的病情判断、预后评估指标提供参考依据。

参考文献：

[1] 常平安，伍一军.有机磷引起的迟发性神经病的发生机制[J].中华劳动卫生职业病杂志，2006,24(6):382-383.

[2] Marcus J,Dupree JL,Popko B.Myelin2 associated glycoprotein and my-elin galactolipids stabilize developing axo-glial interactions[J].J Cell Biol,2002,156:567-577.

[3] 朴丰源.苯甲基磺酰氟对有机磷化合物诱导的迟发型神经毒性的影响[J].大连医科大学学报，2009,31(4):25-27.

[4] Nanda S,Tapaswi PK.Biochemical neuropathological and behavivorals Tudies in hens induced by acute exposure of trortho-cresy phosphate[J].Int J Neurosci,1995,82(3):243-254.

[5] 赖立辉,陈俊杰,徐文桢.髓鞘碱性蛋白研究进展[J].国外医学分子生物学分册,1990,12(5):201-203.

[6] 骆文龙,林代诚,李永懋.面神经修复中再生室内髓鞘碱性蛋白的作用初探[J].中华耳鼻咽喉科杂志,2001,36(6):14-18.

[7] 马崔，侯静，郭扬波.老年期痴呆患者脑脊液神经元特异性烯醇酶、髓鞘碱性蛋白及tau蛋白含量的研究[J].中华神经科杂志，2001，34(2)：79.

[8] 姜红彦,王苏平,李宏元.多发性硬化患者血清 IL - 17水平和髓鞘碱性蛋白相关性的研究[J].大连医科大学学报，2010,32(2):179-180.