2只繁育期雌性大熊猫尿中雌二醇、孕酮含量的变化*

赵鹏鹏,张 强,沈洁娜,徐光岚,侯 佳,马清义,贾康胜,金学林,靳亚平

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵 712100;2.陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心,陕西周至 710402)

2只繁育期雌性大熊猫尿中雌二醇、孕酮含量的变化*

赵鹏鹏1,2,张 强2,沈洁娜2,徐光岚2,侯 佳2,马清义2,贾康胜2,金学林2,靳亚平1

(1.西北农林科技大学动物医学院,陕西杨陵 712100;2.陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心,陕西周至 710402)

利用酶联免疫技术对陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心2只雌性大熊猫发情期、围产期尿中雌二醇、孕酮生殖激素进行检测分析。结果表明,在发情期雌二醇值达到峰值后的24 h内对大熊猫进行人工授精受孕成功的几率较大,雌二醇变化规律与发情行为的变化规律存在一致性;产前孕酮值在峰值后开始出现急剧下降,当孕酮值下降至谷底当日或次日分娩。

大熊猫;酶联免疫;雌二醇;孕酮

大熊猫属于季节性单次发情动物,每年3月～5月份发情一次,属于“三难”动物(发情难、配种受孕难、育幼成活难)[1]。雌性大熊猫的发情鉴定和妊娠诊断技术是解决大熊猫繁殖成败与否的关键环节。随着生殖激素研究的不断发展,对大熊猫生殖激素进行测定已经成为提高大熊猫发情鉴定水平、早期怀孕诊断及进行生殖生理基础理论研究的重要方法。许多学者利用生殖激素测定在大熊猫的发情、排卵和配种及妊娠诊断方面做了大量探讨和研究工作,意在探索和掌握大熊猫的繁殖规律,解决“三难”问题。但在大熊猫的确切排卵时间和适时配种上,国内外尚未达成一致意见[2]。

陕西省珍稀野生动物抢救饲养研究中心针对大熊猫秦岭亚种[3]繁殖难题,利用酶联免疫法对大熊猫尿液中的雌二醇、孕酮等进行了测定分析,并结合阴道黏膜色泽和行为变化等开展了相关研究工作,旨在为提高大熊猫繁育水平,促进大熊猫秦岭亚种保护起到了一定积极作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 1号大熊猫,5岁,体重90 kg,无繁育史,第1次人工授精前44 d出现轻微的发情表现,食欲减退。至前人工授精7 d,每天仅摄取约1 kg水果,出现嬉水、后退翘尾、蹭阴等典型的发情行为,阴门外翻、色泽潮红,试情不接受。至配种前1 d,发情行为未见明显改变,外阴色泽变淡,与种公兽合笼不接受交配,当日进行人工授精。24 h内分合适时间段再次进行人工授精2次。产前35 d出现轻微的行为变化,有挑食现象。至产前18 d不吃竹子,喜卧,乳头肿胀,外阴肿胀。产前5 d彻底不吃食物,哼叫,小幅走动,对外界声光等敏感。临产当日烦躁、走动加剧,产仔双胎,孕期140 d。产后母兽温顺、安静,母性良好。

2号大熊猫,9岁,体重89 kg,有繁育史,第1次人工授精前36 d出现轻微发情行为。至人工授精前3 d,出现按压腰部后退翘尾、蹭阴、主动接近种公兽等典型的发情行为,阴门外翻、色泽潮红,试情接受爬跨。当出现频繁跑动和排尿姿势,追逐种公兽,外阴色泽变淡时,与种公兽合笼未完成交配,进行人工授精。24 h内分合适时间段再次进行人工授精2次。在产前28 d出现轻微的行为变化,同样有挑食现象。至产前11 d不吃竹子,乳房肿胀明显,外阴未见明显变化。产前5 d内一直取吃水果,窝头等食物,外阴有肿胀。临产当日表现惊恐,努责加剧,产仔单胎,孕期140 d。产后母兽温顺、安静,母性良好。

1.1.2 样品 自大熊猫出现轻微的发情行为开始至产后10 d,收集每天上午9:00之前新鲜澄清尿液标记、置-20℃冰箱保存待检。

1.1.3 试剂 雌二醇/孕酮酶联免疫法定量试剂盒,北京北方生物技术研究所生产。

肌酐测定试剂盒,上海荣盛生物技术有限公司生产。

1.1.4 主要仪器 酶标分析仪,工作波长400 nm～700 nm,测量范围0.0～3.0A,线性误差±1.25%～8.0%,重复性≤1.0%,稳定性≤±0.005 A;电脑洗板机,均匀性≤±5%,平均残留量 2 μ L/孔。生化分析仪,工作波长505 nm。

1.2 方法

1.2.1 激素测定 采用酶联免疫竞争法检测尿液中的雌二醇(E2)和孕酮(P4),羊抗兔包被成固相二抗,后加入待测尿液上清液、辣根过氧化物酶标记雌二醇、孕酮以及抗雌二醇抗体,形成包被二抗-抗雌二醇、孕酮抗体-雌二醇(H RP)复合物,标记雌二醇和孕酮的结合量与尿液中的雌二醇和孕酮量成反比。经显色后在酶标仪测定OD值,通过计算机拟合浓度-吸光度标准曲线,反算出待检尿液中的雌二醇和孕酮含量。

1.2.2 肌酐测定 采用饱和苦味酸法测定。取新鲜尿液上清液用蒸馏水50倍稀释,置 37℃水浴30 s后测定,结果乘以50。

1.2.3 尿液激素变化分析方法 为校正每份尿样中水分含量变化带来的差异,将每份尿样中激素浓度除以肌酐浓度,换算成激素浓度与每毫克肌酐的比值作为尿液中激素计量单位[4],即ng/mg Cr。利用Excel绘制每只大熊猫整个繁育期的激素变化趋势图进行分析比较。

2 结果

通过测定1号、2号两只大熊猫3～9月份之间尿中雌二醇、孕酮,发现在发情期和妊娠期中,雌二醇、孕酮的变化呈现明显的规律性(图1和图2)。

为便于分析,选择2只大熊猫在发情期中的首次人工授精当日和围产期中的生产当天为0起点对尿中雌二醇、孕酮的变化进行表述。

2.1 大熊猫发情期雌二醇、孕酮变化

1号大熊猫雌二醇基础值为13.56±8.63 ng/mg Cr,第1次人工授精前7 d雌二醇值开始有显著上升(30.96 ng/mgCr)。至配种前1 d雌二醇值上升到最高 125.82 ng/mgCr,孕酮值为 9.18 ng/mg Cr,当天进行人工授精。其后雌二醇水平值逐渐降低,至第 9天与基础值接近(13.85 ng/mgCr)。

该大熊猫孕酮基础值为3.57 g/mg Cr±3.41 ng/mg Cr,配种后第3天开始有上升趋势(13.73 ng/mgCr),至第 9天变化较大(27.54 ng/mg Cr)。其后又有下降趋势,但较基础值稍高。

2号大熊猫雌二醇基础值为12.13 g/mg Cr±9.72 ng/mg Cr,第1次人工授精前至前3 d雌二醇值开始有显著上升(30.69 ng/mg Cr)。当雌二醇值上升到最高88.69 ng/mg Cr,孕酮值为5.74 ng/mg Cr后,进行人工授精。24 h内分合适时间段再次进行人工授精2次,其后雌二醇值逐渐降低。

该大熊猫孕酮基础期值为3.84 ng/mg Cr±5.66 ng/mg Cr,配种后 4 d未出现较大波动,为48.74 ng/mg Cr。

图1 1号大熊猫3月～8月份雌二醇、孕酮变化曲线Fig.1 Estradiol and progesterone curve of panda 1#from March to August

图2 2号大熊猫4月～9月份雌二醇、孕酮变化曲线Fig.2 Estradiol and progesterone curve of panda 2#from April to September

2.2 大熊猫围产期雌二醇、孕酮变化

1号大熊猫产前5 d孕酮值在33.01 ng/mg Cr～26.27 ng/mg Cr之间,雌二醇值为6.99 ng/mg Cr～15.10 ng/mg Cr之间。临产雌二醇上升至达峰值27.75 ng/mg Cr,孕酮值下降至7.96 ng/mg Cr。产后雌二醇出现上升趋势,孕酮值比较平稳。

2号大熊猫产前5 d内孕酮值在11.02 ng/mg Cr～24.20 ng/mg Cr之间,雌二醇值为 39.63 ng/mg Cr～12.15 ng/mg Cr之间。临产当天雌二醇为19.62 ng/mg Cr,孕酮值最低为2.43 ng/mg Cr。产后雌二醇出现上升趋势,孕酮值趋于平稳。

3 讨论

3.1 发情期变化及配种时间的选择

在发情前期持续时间上,1号大熊猫较长为44 d,2号大熊猫为36 d,在此期间雌二醇变化幅度与基础值相差不大,在11 ng/mg Cr～15 ng/mg Cr范围之间。1号在配种前13 d,2号在配种前11 d雌二醇分别从基础值开始上升。这与喻述容[4]提出的尿中雌酮由基础值上升达峰值需8 d～15 d比较一致。

2只大熊猫在发情期雌二醇的的峰值分别为125.82 ng/mg Cr、88.69ng/mg Cr。与其他研究结果,彭世媛[5](55.47 ng/mg Cr)、谢钟(5.61 ng/mg Cr)等[6]差异较大,但接近杨胜林[7](68.2 ng/mg Cr～177.23 ng/mg Cr)的研究范围。

关于尿中雌二醇浓度与雌兽行为相互关系的研究,Bonney R C[8]、曾国庆等[9]认为,在发情高潮中,尿中雌二醇浓度迅速升高,在发情后期又逐渐下降到发情前水平。本次试验结果与Bonney等研究结果相一致。两只大熊猫在到达配种前3 d～7 d内的雌二醇值突然上升。1号在7 d内由30.96 ng/mg Cr上升至峰值 125.82 ng/mgCr,发情持续时间较长,进度缓慢,在行为表现上相对不太强烈。而2号在3 d内由30.69 ng/mgCr上升至峰值88.69 ng/mgCr,发情高潮期主要表现在雌二醇值较高的3 d内,行为典型,反映强烈,可以配合实施非麻醉状态下的人工授精操作。

在首次人工授精时,两只大熊猫最为典型且一致的特点是两者的外阴颜色由潮红变为粉红色,黏液分泌物开始减少,此时距雌二醇到达峰值至少为3 h(激素检测所需时间)。因此,根据外阴颜色和分泌物减少的现象及人工授精与雌二醇峰值的时间差说明人工授精时雌二醇含量已经从峰值降低。从2只大熊猫当年产仔的实例可以推测,最佳人工授精时机应在雌二醇值达到峰值后的24 h内。彭世媛[5]、谢钟[6]、曾国庆等[9]也认为最佳配种时间是在发情高潮期的当天和次日。

3.2 配种后孕酮变化

1号大熊猫配种后第7天孕酮开始升高27.54 ng/mg Cr,48 d为64.88 ng/mg Cr,79d达最高峰223.64 ng/mg Cr,产前11d从 113.65 ng/mg Cr开始突然下降,在产前5 d孕酮值为33.01 ng/mg Cr开始出现急剧下降,当孕酮值下降至谷底当日或次日生产,产后孕酮值趋于基础值。

2号大熊猫配种后第7天孕酮开始上升为48.78 ng/mg Cr,64 d为74.08 ng/mg Cr,118 d为峰值622.70 ng/mgCr,产前 11 d从 70.54 ng/mg Cr开始突然下降,在产前5d内孕酮值为39.63 ng/mg Cr开始出现急剧下降,当孕酮值下降至谷底当天或次日生产,产后孕酮值趋于基础值。

两者的孕酮分别在配种后 48 d、64 d上升到60 ng/mg Cr以上并在此水平之上维持81 d、65 d。在此期间,孕酮维持在较高水平,可能是胚胎较快发育并大量分泌孕酮的结果。妊娠期间孕酮变化趋势也反映了胚胎发育停滞、迅速发育和临产3个阶段,与彭世媛等[5]的研究结果相吻合。

本试验中,2只大熊猫在发情期雌二醇值达到峰值后的24 h内对其进行人工授精受孕成功的几率较大。雌二醇含量的改变与发情行为的变化存在一致性;产前孕酮值在峰值后开始出现急剧下降,当孕酮值下降至谷底当天或次日生产。

受大熊猫数量、年龄、体重、生理状况及试验方法等多因素的影响,因此试验结果仅供参考,还有待进一步扩大数量进行研究。

[1]赵学敏.大熊猫-人类共有的自然遗产[M].北京:中国林业出版社,2006,8:167

[2]周杰珑,郑鸿培,郭爱伟.大熊猫体液激素与排卵与配种关系的研究进展[J].畜禽业,2007,7(219):28-30.

[3]Wan Qin-hong,Wu Hua,Fang Sheng-guo.A new subspecies of giant panda from Shaanxi,China[J].J Mammal,2005,86(2):397-402.

[4]喻述容,张志和,余建秋,等.繁殖期雌性大熊猫尿中激素变化的研究[J].畜牧兽医学报,2003,34(5):452-456.

[5]彭世媛,李复东,叶志勇,等.雌性大熊猫发情期与妊娠期尿液雌激素的变化[J].动物学杂志,1993,28(2):25-28.

[6]谢 钟,刘维新,刘农林.大熊猫尿中雌二醇、孕酮含量周期性变化的初步研究.成都国际大熊猫保护学术研讨会论文集[C].四川成都:四川科学技术出版社,1994:238-242.

[7]杨胜林,李 敏,周 强,等.雌性大熊猫发情行为观察与相关指标分析[J].四川动物,2007,26(3):664-668.

[8]Bonney R C,Dcborah J W,Kleiman D G.Endocrine correlates of behavioral estrus in the female giant panda and associated hormonacel ranges in the male[J].Repord Fertil,1982,64(1):209-215.

[9]曾国庆,蒋广泰,杨克勤,等.大熊猫发情期血中和尿液中促黄体素、孕酮和 17β-雌二醇含量的变化[J].动物学报,1990,36(1):63-69.

Variation of Estradiol and Progesterone Levels in Urine of Female Giant Pandas During the Breeding Season

ZHAO Peng-peng1,2,ZHANG Qiang2,SHEN Jie-na2,XU Guang-lan2,HOU Jia2,MA Qing-yi2,JIA Kang-sheng2,JIN Xue-lin2,JING Ya-ping1

(1.College of Veterinay Medicine,Northwest A&F University,Y angling,Shaanxi,712100,China;2.Shaanxi Rare Wildli fe Rescue Breeding Research Center,Zhouzhi,Shaanxi,710402,China)

Estradiol and progesterone hormones in the urine of two female pandas during the estrous and perinatal period were detected and analyzed by using ELISA technology in Shaanxi Rare Wildlife Rescue Breeding Research Center.The results showed that the artificial insemination of giant pandas conceived a greater chance of success within 24 hours after the peak of estradiol,there was a consistency between estrous variation and estradiol variation;progesterone peak declineed sharply before delivery,when the progesterone dropped to the bottom,the delivery came in the same day or the next day.

giant panda;ELISA;estradiol;progesterone

S865.31

A

1007-5038(2011)07-0045-04

2010-11-22

赵鹏鹏(1979-),男,宁夏隆德人,兽医师,兽医硕士生,主要从事大熊猫繁育研究。