辛伐他汀对冠心病患者主动脉MMP-2和MMP-9的影响

冯增斌 刘志伟 肖 锋 胡建功 房大广

(承德医学院附属医院心脏外科，河北 承德 067000)

动脉粥样硬化不稳定斑块破裂是急性冠脉综合征发生的主要原因。基质金属蛋白酶(MMPs)家族中的MMP-2、MMP-9可导致斑块纤维帽基质的降解使得斑块易于破裂而导致急性冠脉综合征的发生〔1〕。辛伐他汀可降低大鼠、家兔主动脉组织内MMP-2，MMP-9的含量及表达〔2〕，对于人类临床研究文献较少。本试验旨在研究冠心病行冠状动脉移植术患者应用辛伐他汀后主动脉组织及血清内MMP-2、MMP-9含量的变化，探讨药物干预的可能机制，给临床用药提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 我院自2007年2月至2009年9月行冠状动脉旁路移植术患者46例，均行冠脉造影检查证实有三支冠状动脉狭窄或左主干病变，具备手术指征。近期无发热、感染、合并免疫性疾病、肿瘤及肝、肾功能异常。术前全部服用硝酸异山梨醇酯、贝他乐克、阿司匹林等药物，并皮下注射低分子肝素。其中27例服用辛伐他汀4 w以上，20 mg/d，睡前服用，此组为治疗组。另有19例患者未进行降脂治疗，未服用过他汀类药物，为对照组。治疗组男16例、女11例，年龄46～68〔平均(56±9)〕岁，10例有心肌梗死病史，5例合并室壁瘤，15例血甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDLC)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、载脂蛋白B(ApoB)全部正常，12例有不同程度升高。对照组男13例、女6例，年龄50～65〔平均(57±5)〕岁，均无心肌梗死病史及室壁瘤，查血脂5例全部正常，14例有不同程度升高。

1.2 试剂 辛伐他汀(商品名舒降之)由杭州默沙东公司提供。MMP-2，MMP-9试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司的双抗体夹心酶联免疫试剂盒。MMP-2，MMP-9鼠抗人单克隆抗体购于武汉博士德公司。

1.3 标本采集 两组患者经禁食12 h后，分别于术前经置入的颈静脉插管抽取静脉血4 ml，置于干燥玻璃试管中，室温静置30 min后3 000 r/min离心15 min，分离血清，统一编号，－70℃冰箱保存。术中除乳内动脉与前降支吻合，其余血管桥均使用大隐静脉。两组患者采用静脉桥(1.8±0.5)支。选择升主动脉前壁打孔并与静脉桥近端吻合。留取打孔器圆刃切下的主动脉组织石蜡包埋。

1.4 血清MMP-2、MMP-9的测定 采用酶联免疫法(ELISA)测定。抗人多克隆抗体MMP-2(一抗)预先包被于酶标板上，分别加入标准液和待测血清样本。MMP-2与一抗特异性结合。加入生物素化的抗人MMP-2(二抗)，与在单抗上的人MMP-2结合而形成免疫复合物，未结合的被洗去。辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与二抗的生物素结合，多余的物质被洗掉。加入四甲基联苯胺(TMB)染色。最后加入终止液。置酶标分析仪中测量OD值。MMP-9测定同上。

1.5 主动脉组织MMP-2、MMP-9表达的测定 用链霉亲合素-生物素-过氧化物酶(SABC)法染色。以胞浆或胞膜呈均一棕黄色颗粒为阳性，无棕黄色颗粒者为阴性。方法及试剂:石蜡标本4μm连续切片，脱蜡至水。免疫组织化学染色按说明书指示进行;H2O2室温灭活过氧化物酶，胰蛋白酶消化，柠檬酸微波修复。正常羊血清室温封闭非特异抗原位点，滴加一抗(鼠抗人MMP-2单克隆抗体1∶50，鼠抗人MMP-9单克隆抗体1∶50)，37℃孵育2 h，滴加 SABC 复合物(1∶200)37℃ 20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，二氨基联苯胺(DAB)染色，苏木精复染，脱水，透明，封片。

1.6 统计学分析 应用SPSS13.0统计软件，数据用x±s表示，计数资料比较采用χ2检验，计量资料比较采用t检验。

2 结果

辛伐他汀组患者血清内MMP-2、MMP-9的含量明显低于对照组(P＜0.01)。辛伐他汀组患者主动脉组织MMP-2〔10(27.0%)vs 11(57.9%)〕、MMP-9〔8(29.6%)vs 13(68.4%)〕的阳性表达明显低于对照组(P＜0.01)。见表1，图1，图 2。

表1 两组患者血清内MMP-2、MMP-9的含量(x±s)

图1 主动脉组织MMP-2表达(×200)

图2 主动脉组织MMP-9表达(×200)

3 讨论

MMPs家族成员有20多种，其中MMP-2，MMP-9是血管壁细胞表达和分泌的最主要的MMP，在内膜损伤和粥样病变形成的过程中起关键作用。故有作者认为血清MMPs水平能反映动脉硬化的病变程度〔3〕。动物试验证实，MMP-2，MMP-9在高胆固醇兔动脉损伤的早期即有表达，在不稳定斑块中显著表达〔4〕。在炎性因子启动下，粥样斑块内高浓度浸润的巨噬细胞可释放大量MMPs。Brown〔1〕等对冠心病患者经介入治疗，旋切下的动脉粥样硬化斑块的MMP-2，MMP-9检测表明，不稳定心绞痛患者其表达水平显著高于稳定心绞痛患者。

近年许多关于他汀类药物的临床试验结果表明，该类药物可以明显减缓冠心病患者动脉硬化病变的进展，且具有独立其降脂作用外的稳定斑块的作用，他汀类药物能够降低急性冠脉综合征患者血清MMPs水平。2000年，Ikeda〔5〕等报道氟伐他汀能够抑制人血管内皮细胞的MMP-1表达。这些研究均从他汀类药物对细胞的直接作用观察该类药物对细胞MMPs表达的影响，并得出较肯定的结论。他汀类药物抑制MMPs表达的机制尚不清楚，根据Yang等〔6〕的研究，可能与细胞外MMPs引导物(EMMPRN)有关。EMMPRN在人类单核/巨噬细胞中表达，并通过非胆固醇依赖的转录因子调节，在MMPs合成前48 h的活性作用达到高峰。EMMPRN在MMPs的合成中起着重要作用，他汀类药物则可通过抑制EMMPRN转录因子从而抑制EMMPRN的基因表达，导致MMPs的合成受到抑制。

本试验结果提示辛伐他汀通过减少主动脉组织MMP-2，MMP-9的表达，从而减少细胞外基质成分降解，减轻血管损伤，延缓动脉粥样硬化病变，减少急性心血管事件。提示降低MMP-2，MMP-9表达水平可能是辛伐他汀抗动脉粥样硬化机制之一。

1 Brown DL，Desai KK，Vakili BA，et al.Clinical and biochemical results of the metalloproteinase inhibition with subantimicrobial doses of doxycycline to prevent acute coronary syndromes(MIDAS)pilot trial〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004;24(4):733-8.

2 Loftus IM，Thompson MM.The role of matrix metalloproteinases in vascular disease〔J〕.Vasc Med，2002;7(2):117-33.

3 Huang CY，Wu TC，Lin WT，et al.Effects of simvastatin withdrawal on serum matrix metalloproteinases in hypercholesterolaemic patients〔J〕.Eur J Clin Invest，2006;36(2):76-84.

4 Freestone T，Turner RJ，Higman DJ，et al.Influence of hypercholesterolemia and adventitial inflammation on the development of aortic aneurysm in rabbits〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，1997;17(1):10-7.

5 Ikeda U，Shimpo M，Ohki R，et al.Fluvastatin inhibits matrix metalloproteinase-1 expression in human vascular endothelial cells〔J〕.Hypertension，2000;36(3):325-9.

6 Yang JM，Xu Z，Wu H，et al.Overexpression of extracellular matrix metalloproteinase inducer in multidrug resistant cancer cells〔J〕.Mol Cancer Res，2003;1(6):420-7.