辛伐他汀对大鼠脑缺血再灌注损伤细胞凋亡的影响

王柏欣 王 昕 邱洪斌 王淑秋 陈 梅 王景涛 徐 辉 陈廷玉

(佳木斯大学，黑龙江 佳木斯 154007)

他汀类药物是新一代调脂药，可竞争性抑制胆固醇合成酶系中的关键酶羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，使胆固醇合成受到限制。辛伐他汀为半合成他汀类药物，在缺血性卒中、多发性硬化、Alzheimer病等神经系统疾病中有广泛神经保护作用〔1～3〕。本实验采用大鼠局灶性脑缺血模型，观察辛伐他汀对大鼠脑缺血损伤后细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组 健康成年Wistar大鼠，250～300 g，随机分为四组，空白对照组，假手术组，模型组，辛伐他汀组。模型组和辛伐他汀组都应用线栓法建立大鼠脑缺血再灌注损伤模型，模型组根据再灌注时间分为1，2，3，5，7 d。辛伐他汀组也根据用药时间再分为用药 1，2，3，5，7 d。

1.2 试剂 辛伐他汀(浙江京新药业股份有限公司)，细胞凋亡试剂盒(In situ cell apoptosis Detection kit I，POD)(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 建立脑缺血再灌注模型 根据Longa法〔4〕大脑中动脉栓塞法制备脑缺血再灌注模型。动物称重，10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，将动物仰卧位固定(上门齿、四肢远端用粗线固定于鼠板上)，碘伏消毒颈部皮肤，颈部正中切口，分离出颈总动脉、颈外动脉以及颈内动脉，分别接扎颈总动脉及颈外动脉，在颈总动脉距离分叉处将尼龙线导入颈内动脉，插入线栓深度约为(18.0±0.5)mm，感到轻微阻力时立即停止插线。此后缝合伤口，留置线头于体外，30 min后将线拴提至颈总动脉内，完成再灌注。术后将室温控制在25℃ ～30℃，视动物状况注射呋塞米或抗生素预防脑水肿和感染。假手术组除进线1.5 mm外，其余相同。辛伐他汀组模型制作成功后，在术后第1天开始给药。

1.3.2 大鼠神经功能Zea-longa评分〔4〕无神经功能缺失症状，活动正常者，计0分;不能完全伸展对侧前爪，计1分;动物爬行时出现向右转圈(追尾现象)，计2分;身体向偏瘫侧倾倒者，计3分;不能自发行走，意识丧失者，计4分。评分为0分和4分者均被剔除，神经功能评价在取材前进行。

1.3.3 组织切片的制备 各组实验结束点将动物麻醉，经左心室插管快速灌注生理盐水约250 ml进行心脏灌洗，用4%多聚甲醛灌洗固定，迅速断头取脑，于视交叉后冠状切取3 mm厚度组织块，4%多聚甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，切片。HE染色观察病理形态学改变，神经细胞TUNEL染色法，观察细胞凋亡情况:切片常规脱蜡入水，按照试剂盒说明书操作，DAB显色10～30 min，水洗，苏木素轻度复染，水洗，脱水，透明，封片。光镜下观察正常细胞核被染成蓝色，凋亡细胞核被染成棕黄色。凋亡细胞计数方法:选取脑皮层部位，200倍光镜下计数5个视野阳性细胞数目，求其平均值。

1.3.4 电镜法 各组动物大脑皮层部位脑组织，常规透射电镜样品制备(锇酸后固定2 h，0.1 mmol PBS漂洗，50%、70%、80%、90%、100%、乙醇逐级脱水，纯丙酮置换，Epon812包埋，60℃聚合48 h，超薄切片经铀-铅双染)，使用电镜对大脑皮层脑组织进行观察。

1.4 统计学方法 计量资料以x±s表示。不同时点间比较采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 HE染色结果 空白对照组(即正常组)形态结构未见异常，假手术组染色深，细胞形态和结构无异常。模型组，随着再灌注时间的不同出现不同程度细胞形态和结构异常，胞体和胞核固缩，深染，核仁不清楚，甚至出现神经元核破裂。辛伐他汀组也出现不同程度细胞形态和结构异常，胞体和胞核固缩甚至核破裂，但是相对于模型组同时间比较数量减少，程度较弱，以3 d最显著。见图1。

2.2 电镜法检测结果 假手术组脑细胞染色质分布均匀，核膜完整，核孔清晰可见，细胞器结构完好。模型组与假手术组相比线粒体数量减少，部分线粒体嵴减少，板层小体数目减少，排空增多。辛伐他汀组可以减轻此种情况，线粒体呈圆形或卵圆形，嵴较清楚，微绒毛较完整，板层小体结构较完整，仅出现少量的线粒体空泡。见图2。

2.3 TUNEL法检测结果 空白对照组(即正常组)未见凋亡细胞，假手术组仅有零星凋亡细胞，模型组与辛伐他汀组各亚组在缺血再灌注1 d后凋亡细胞开始升高，在3 d达到高峰，随后下降;辛伐他汀组与模型组在相同时间点组间比较，凋亡细胞数量明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05)。以第3天表现最显著，见表1、图3。

表1 辛伐他汀对大鼠局部脑缺血再灌注不同时点脑细胞凋亡的影响(x±s，n=6，个/200 倍视野)

图1 HE染色观察各组神经细胞病理形态学改变(×200)

图2 电镜下观察各组细胞超微结构

图3 TUNEL法观察各组神经细胞凋亡情况(×200)

3 讨论

缺血性脑血管病(ICVD)在脑血管病中最为常见，在我国因其具有发病率上升及发病年龄的年轻化趋势而日益受到医学界的重视〔5〕。近年的研究表明，细胞凋亡是脑缺血病理作用的重要环节，是造成脑缺血后继发性损害的重要机制〔5，6〕，脑缺血再灌注后神经细胞损害的分子机制迄今尚未完全被阐明。脑缺血后神经元的死亡主要表现为坏死和凋亡两种形式。细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动的死亡方式，受细胞内、外因子调控。在脑缺血再灌注的中心区，由于血液供给急剧减少，细胞能量供给缺乏，ATP耗竭，Na+/K+泵衰竭，导致大多数细胞肿胀，坏死;而在缺血半暗带区由于有侧支循环供血，缺血程度较缺血中心区轻，存在部分能量供应，则细胞损害相对较轻而进展慢;“再灌注损伤”可产生钙离子失衡，内质网和线粒体功能异常，过氧化作用增强等，这些均可以导致DNA损伤，后者如不能及时修复，积累到一定程度，则可通过启动凋亡程序，引起细胞凋亡，并随再灌注时间延长，DNA损伤积累，凋亡细胞亦不断增加〔7〕。目前认为，凋亡在脑缺血-再灌注损伤的发病机制中发挥着重要作用，并且对梗死的形成过程有着重要的影响。近来的研究表明，辛伐他汀具有多向性神经保护功能〔8〕，能降低脑卒中的发病率并减轻再灌注损伤〔9〕，但其机制尚未明了。神经细胞凋亡是造成缺血-再灌注损伤的重要因素，凋亡神经细胞的多少决定着脑损伤最终范围的大小〔10〕，因此，防治细胞凋亡是减轻再灌注损伤的重要环节。本实验结果表明，脑缺血再灌注损伤后出现明显的细胞凋亡，经过辛伐他汀治疗后，细胞凋亡数目和程度明显降低，说明辛伐他汀具有一定的抑制凋亡的作用，并可能通过抑制神经细胞凋亡而保护大鼠脑缺血再灌注所致的损伤，但其抑制凋亡的机制还有待进一步研究。

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4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniotomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20(1):84-91.

5 Wang P，Wang W，Xuy L，et al.Comparison of focal cerebral ischemia/reperfusion induced apoptosis of astrocytes and neurons in rats〔J〕.Chin J Histochem Cytochem，2006;16(2):113-8.

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8 谢 坤，李 勇.他汀类药物的多效性研究〔J〕.世界临床药物，2005;26:589-91.

9 Tobert JA.Lovastatin and beyond:the history of the HMG-CoA reductase inhibitors〔J〕.Nat Rev Drug Discov，2003;2:517-26.

10 李小刚，朱 克，李 楠，等.谷氨酸对神经细胞钙离子内流和凋亡的影响及谷氨酸受体拮抗剂保护作用的研究〔J〕.中华老年心脑血管疾病杂志，2001;3:122-5.