硫酸镁对小鼠全脑缺血再灌注损伤的保护作用

杨卫东 董银凤 朱旭友 吕鸿燕 陈前芬

(蚌埠医学院机能实验中心，安徽 蚌埠 233030)

缺血性脑卒中具有发病率高、死亡率高、致残率高等特点，因此缺血性脑卒中的防治成为社会和医学界关注的重要课题。研究表明N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体介导的神经兴奋毒性在缺血性脑损伤中起关键的作用。当NMDA受体兴奋时，大量Ca2+内流引起钙超载。Mg2+是Ca2+的天然拮抗剂，可通过非竞争性抑制NMDA受体来有效减少Ca2+内流，从而改善脑组织细胞损伤〔1〕。近年引起人们的重视。本研究利用小鼠全脑缺血再灌注损伤模型，通过观察硫酸镁(MgSO4)预处理及治疗对小鼠全脑缺血再灌注一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)及ATP酶的影响，探讨MgSO4对脑缺血再灌注损伤的保护作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂与仪器 MgSO4注射液(购于扬州中宝公司)，NOS及NO测定试剂盒及钠钾、钙镁ATP酶活性测定试剂盒(均购自南京建成生物工程研究所)。FSH-2型高速电动匀浆器(江苏金坛医疗仪器厂产)，756-MC型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司产)。

1.2 动物与分组 健康昆明种小鼠80只，体重(25±5)g，雌雄兼用，由我院实验动物科提供。随机均分为以下各组，假手术组:仅行手术，不实施脑缺血;再灌组:缺血30 min，再灌注1 h;MgSO4预处理组和治疗组各分为低、中、高剂量组，分别于缺血前 30 min腹腔注射25、50、100 mg/kg MgSO4，然后缺血30 min，再灌注 1 h，和再灌后即刻给予腹腔注射 90、180、360 mg/kg MgSO4。前两组腹腔注射等体积生理盐水。

1.3 全脑缺血/再灌注损伤动物模型的建立 10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)小鼠腹腔注射麻醉。采用我室改进的小鼠全脑缺血/再灌注损伤的动物模型〔2〕。全脑缺血30 min，予以解压再灌60 min。

1.4 标本制备及处理 各组动物动态观察到预定的时间后，用20%乌拉坦过量麻醉处死，开颅，取左侧大脑皮质，称重，制成10%组织匀浆，硝酸还原法测定NO含量，测定诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、总一氧化氮合酶(T-NOS)活性及考马斯亮蓝法测定蛋白含量。右半大脑10%甲醛溶液固定，48 h后于乳头体及视交叉平面行冠状切开，制成脑片，HE染色，光镜观察脑皮层病理学变化。

1.5 统计学方法 采用应用SPSS14.0统计软件包进行单因素方差分析和q检验及t检验。

2 结果

2.1 病理学检查结果 假手术组神经细胞胞膜清晰完整，无变性、水肿，核仁清晰可见。再灌注组神经细胞及胶质细胞均肿胀、变性坏死，胞膜不清，胞核固缩，神经纤维网呈空泡样改变，间质水肿明显，细胞及血管周围间隙增大。硫酸镁治疗和预处理各用药组神经细胞水肿程度有一定减轻，神经细胞及间质仅有轻微水肿，核仁清晰，脑各部位结构及层次较再灌组清楚各组之间差别不明显，见图1。

2.2 大脑内NO含量和NOS、iNOS活性的变化 表1可见，脑内NO含量和NOS、iNOS活性缺血再灌注组均高于假手术组，有显著性差异(P＜0.01);MgSO4治疗组和预处理各组脑组织T-NOS和iNOS活性及NO含量均低于再灌组有显著性差异(P＜0.01)，MgSO4治疗组各不同剂量治疗组间均有差异(P＜0.05)。MgSO4预处理高剂量组的T-NOS活性与中、低剂量组比较有显著性差异(P＜0.05)，而中剂量组与低剂量组比较无显著性差异(P＞0.05)。NO含量、iNOS活性不同剂量MgSO4预处理各组间相比均无差异(P＞0.05)。MgSO4治疗组和预处理T-NOS和iNOS活性的有显著性差异(P＜0.01);NO含量高剂量组比较有显著性差异(P＜0.05)。

表1 各组小鼠脑组织NO、T-NOS和iNOS活性比较(x ± s，n=10)

图1 病理学检查结果(HE，×400)

2.3 钠钾、钙镁-ATP酶 缺血再灌注组钠钾、钙镁-ATP酶的活性均低于假手术组和治疗组、预处理组有显著性差异(P＜0.05)。钠钾ATP酶预处理与治疗组之间的差异没有统计学意义(P＞0.05);钙镁ATP酶预处理与治疗组间有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 钠钾-ATP酶、钙镁-ATP酶活性比较(x ± s，n=10)

3 讨论

随着对脑损伤机制的认识深入，MgSO4作为一种价廉而有效的脑保护剂备受人们关注，目前众多研究表明，MgSO4是生理性的钙拮抗剂和ATP酶活化剂〔1〕，还可以提高缺血组织中SOD等抗氧化酶活性，清除氧自由基〔3〕，抑制膜脂质过氧化反应，减轻自由基损伤。李键等〔4〕实验表明，MgSO4预处理能降低NO含量和GSH活性，对人脐静脉内皮细胞缺氧再复氧损伤起保护作用。我们的实验结果表明在小鼠全脑缺血再灌注损伤时脑内的iNOS及NO均显著增加，脑组织病理学显示脑组织的损伤加重。无论是MgSO4预处理还是治疗均能减少iNOS及NO合成，组织病理学检查也提示脑组织损伤明显减轻。从而表明，脑缺血再灌注损伤后，脑内兴奋性氨基酸增多，NMDA受体激活，大量Ca2+内流，还可增加iNOS mRNA的转录，从而升高细胞内NOS表达的水平。在NOS的作用下NO迅速合成，介导神经细胞损伤〔5〕。Mg2+是天然的钙离子拮抗剂，同时作为一种非竞争性兴奋性氨基酸(EAA)受体拮抗剂，具有阻断NMDA受体，可阻滞兴奋性氨基酸受体介导的钙内流，减轻兴奋性毒性损伤的作用，并通过阻滞Ca2+内流而最终抑制有害iNOS及NO合成，减轻脑组织损伤。

实验和临床均发现，急性缺血性脑卒中的动物或患者体内都存在着严重的低镁。Lampl等〔6〕对96例24～48 h以内急性缺血性卒中患者入院时查血清和脑脊液镁离子浓度，并用Mathew评分法评分，结果发现，缺血性卒中发生后48 h神经功能缺损的程度与脑脊液镁浓度低有关。Heath等〔7〕用磷核磁共振波谱学方法研究证实，脑损伤时MgSO4和MgCl2均能透过血脑屏障进入损伤组织。Fuchs-Buder等〔8〕对20例神经外科病人静脉注射MgSO4时镁通过血脑屏障的研究证明，病人经静脉一次注射MgSO460 mg/kg，在注射后30、90和240 min时血清和脑脊液镁离子浓度均增加。我们的实验证明，随着镁浓度增高可提高对脑的保护作用，MgSO4血药浓度与疗效呈正相关。治疗组在降低iNOS活性及NO含量作用比预处理组更明显。

Mg2+是体内一种内源性保护因子，是体内许多重要酶的辅助因子。不仅是生理性钙拮抗剂还是ATP酶活化剂，在ATP的代谢和跨膜离子传递中起着极重要的作用。ATP酶是逆离子浓度梯度进行细胞膜内外转运的离子泵，此过程需要能量。脑血流一旦完全阻断，ATP耗尽，膜离子泵功能障碍，K+流出，Na+、Ca2+和水大量进入细胞内。导致细胞肿胀，使梗死灶周围去极化，半暗带功能损害。我们的实验也表明，脑缺血再灌注损伤后，Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均显著降低。组织病理学表明脑缺血再灌注损伤后神经细胞及胶质细胞均极度肿胀。皮层充血，间质水肿明显。MgSO4预处理或治疗后均显示:Na+-K+-ATP酶和Ca2+-Mg2+-ATP酶活性均增高。脑组织轻度肿胀。变性坏死神经细胞水肿程度减轻明显。表明提高细胞外Mg2+可抑制K+外流，并可拮抗Ca2+离子内流，从而减少自由基的产生，防止了神经细胞的坏死与凋亡，保障了细胞膜的稳定性。

1 黄 越，王维治，张玉梅，等.硫酸镁对大鼠急性缺血再灌注损伤时ATP酶的影响〔J〕.中国神经免疫学和神经病学杂志，2002;9(3):153-6.

2 陈前芬，祝晓光，杨卫东，等.小白鼠全脑缺血∕再灌注损伤模型的改进〔J〕.中国药理学通报，2000;16(5):577-9.

3 李增宏，罗 俊，林宏城，等.硫酸镁注射液对大鼠肾缺血再灌注损伤的保护作用〔J〕.中山大学学报论丛，2007;27(3):152-4.

4 李 键，董果雄，冯义柏.硫酸镁预处理对人脐静脉内皮细胞缺氧再复氧损伤的保护作用〔J〕.中国老年学杂志，2006;26(9):1247-8.

5 季占胜，唐学东，闵连秋.硫酸镁的脑保护作用〔J〕.医学综述，2005;11(7):666-8.

6 Lampl Y，Geva D，Gilad R，et al.Cerebrospinal fluid magnesium level asa prognostic factor in ischemic stroke〔J〕.JNeurol，1998;245(9):5842-8.

7 Heath DL，Vink R.Neuroprotective effects of MgSO4and MgCl2in closed head injury:a comparative phosphorus NMR study〔J〕.J Neurotrauma，1989;15(3):183-9.

8 Fuchs-Buder T，Tramer MR，Tassonyi E.Cerebrospinal fluid passage of intravenous magnesium sulfate in neurosurgical patients〔J〕.JNeursurg Anesthesiol，1997;9(4):324-8.