虫草头孢菌粉水提物抗实验性心律失常作用的研究

姚红伊，沈 礼，林国华，沈岳良，王如伟，谢强敏，颜小锋

(1.浙江大学医学院附属第二医院药剂科，浙江杭州 310009;2.杭州师范大学基础医学部，浙江 杭州 310018;3.浙江大学医学院病理学与病理生理学系，浙江杭州 310058;4.浙江康恩贝制药股份有限公司，浙江杭州 310052)

冬虫夏草(Cordyceps Sinemis)是我国的传统的中药材，传统中医药理论认为其具有补肺益肾等功效［1－2］。近年的研究表明，冬虫夏草还具有抗心律失常及保护缺血心肌等作用［3－5］。但由于其特殊的生长环境和习性，使得冬虫夏草数量稀少，资源稀缺。以往的研究者们虽然采用对从冬虫夏草中分离出来的真菌菌株进行大规模深层发酵培养的方法获得了相对高产的虫草菌粉，但由于虫草菌粉中含有虫草多糖、虫草素、生物碱、核苷类等多种成分，因此存在物质组成复杂，药效物质不明确等缺点。且受到制备技术的限制，常规得到的虫草菌粉存在着抗心律失常的作用弱、缺乏特异性，以及有效成分不明确等问题。故本实验采用改良技术(专利号 ZL 200610052509.6)获取虫草头孢菌粉(Cordyceps Cephalosporium Mycelia，CCM)的有效部位，在氯仿、乌头碱和缺血/再灌诱发的实验性心律失常模型上，进一步研究该改良技术提取的虫草头孢菌粉是否具有有效对抗实验性心律失常的作用。

1 材料与方法

1.1动物KM种小鼠，♀♂各半，体质量20～22 g。♂SD大鼠，体质量205～235 g。以上均由杭州师范大学实验动物中心〔实验动物生产许可证SCXK(浙)2005-0020，使用许可证SYXK(浙)2005-0070〕提供。1.2试剂和仪器虫草头孢(C.sisensis Chen.sp.nov)由浙江康恩贝制药股份有限公司制备。虫草头孢菌粉活性有效部位由浙江现代中药与天然药物研究院有限公司采用中国专利号ZL 200610052509.6的方法提取，主要含有尿苷35%、腺苷38.1%和胸苷13.0%。临用前先将CCM溶解于生理盐水配成100 g·L－1母液，然后依次用生理盐水配成各浓度的工作液。

乌头碱(中国药品生物制品检定所，110720-200410)配制:先用0.1 mol·L－1HCl溶解，加生理盐水稀释，加1 mol·L－1NaOH调pH至6，加生理盐水足量至10 mg·L－1，冰箱保存3 d有效。氯仿由浙江迪耳药业有限公司生产。戊巴比妥钠和胺碘酮由美国Sigma公司生产。乌拉坦由上海天莲精细化工有限公司提供。利多卡因(lidocaine)由石家庄新华制药厂生产。其他试剂均为国产分析纯。生物信号采集处理系统(RM6240C)成都仪器厂生产。

1.3氯仿诱发的小鼠心律失常模型取100只KM小鼠，♀♂各半，将小鼠随机分成5组(n=20)，分别给予以下处理:①空白对照组:给予生理盐水。② 阳性对照组:给予40 mg·kg－1胺碘酮(amiodarone)。③ 低、中、高浓度CCM提取物组:分别给予50、100、200 mg·kg－1CCM 提取物。以上各组均尾静脉给药，给药体积为0.005 ml·g－1体重。给药15 min后，将小鼠放入500 ml玻璃罩内，罩内预先放入浸有4 ml氯仿的棉球，至呼吸停止5 s后，立即取出，采用标准肢体Ⅱ导联记录心电图曲线，观察小鼠室颤(ventricular fibrillation，VF)发生率，记录各组产生室颤的动物数。

1.4乌头碱诱发的大鼠心律失常模型取40只♂SD大鼠，随机分为5组(n=8)，分别给予以下处理:①空白对照组:给予生理盐水。② 阳性对照组:给予20 mg·kg－1利多卡因。③ 低、中、高浓度CCM 提取物组:分别给予 50、100、200 mg·kg－1CCM提取物。以上各组均尾静脉给药，给药体积为2 ml·kg－1体重。大鼠用乌拉坦 1.25 g·kg－1腹腔麻醉后仰卧固定，经尾静脉给予不同药物10 min后，将乌头碱以经颈外静脉恒速(2 μg·min－1)灌注，采用标准肢体Ⅱ导联记录心电图曲线。观察室性早搏(ventricular premature beats，VPB)、室性心动过速(ventricular tachycardia，VT)和室颤(VF)出现的时间，并计算相应的体重累积乌头碱用量。

1.5缺血/再灌诱发的大鼠心律失常模型取32只♂SD大鼠，随机分为4组(n=8)，分别给予以下处理:① 空白对照组:给予生理盐水。② 低、中、高浓度CCM 提取物组:分别给予50、100、200 mg·kg－1CCM提取物。以上各组均颈外静脉给药，给药体积为2 ml·kg－1体重。大鼠戊巴比妥钠麻醉后仰位固定，开胸暴露心脏，以肺动脉圆锥与左心耳交界处的左冠状静脉为标志，用6/0外科缝线于左心耳下缘2 mm处进针，穿过左冠状动脉前降支及浅层心肌，以备结扎，记录标准肢体Ⅱ导联心电图。以结扎10 min作为缺血，心电图ST段持续抬高作为结扎成功的标志;松开结扣10 min作为复灌。各组药物均在结扎前5 min颈外静脉注射。记录缺血/再灌注期间室早发生频率，室速和室颤的发生率和持续时间。采用Mest方法评定心律失常分数:0分:窦性心律;20分:Ⅰ°房室传导阻滞，室上性心律失常;40分:室性早搏二联律、三联律，Ⅱ°房室传导阻滞;60分:多源性室早，阵发室速;80分:室颤;100分:死亡。

1.6统计学处理在氯仿诱发的室颤发生率实验中，实验数据以百分比表示，并采用χ2检验判断各组的差异。其他数据以±s表示，采用one-way ANOVA以及Newman-Keuls post hoc test做统计学分析。

2 结果

2.1CCM提取物对抗氯仿诱导的小鼠心律失常的作用与对照组比较，CCM提取物低、中、高3个浓度组均能降低小鼠室颤发生率，且CCM提取物对小鼠室颤发生率的抑制具有一定的剂量依赖性(Tab 1)，表明CCM提取物对氯仿诱发的心律失常有较好的拮抗作用。

Tab 1 Effect of CCM on chloroform induced arrhythmia in mice(±s，n=20)

Tab 1 Effect of CCM on chloroform induced arrhythmia in mice(±s，n=20)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·kg－1 Number of VF occurrence/total VF rate/%Control 19/20 95.0 CCM 50 13/20 65.0*CCM 100 10/20 50.0＊＊CCM 200 7/20 35.0＊＊Amiodarone 40 6/20 30.0＊＊

2.2CCM提取物对抗乌头碱诱导的大鼠心律失常的作用与对照组比较，各浓度CCM提取物组可明显延长各类心律失常出现的潜伏时间，相应的体重累积乌头碱用量也增加(Tab 2)，表明CCM提取物对乌头碱诱发的心律失常有较好的拮抗作用。

2.3CCM提取物对抗缺血/再灌诱导的大鼠心律失常的作用与对照组相比，各浓度CCM提取物组可明显减少VPB发生次数、VT与VF的发生率和持续时间;且室性心律失常评分也明显降低(Tab 3)，表明CCM提取物对缺血/再灌诱发的心律失常有较好的拮抗作用。

3 讨论

Tab 2 Effect of CCM on aconitine induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of CCM on aconitine induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Dose/mg·kg－1 Accumulated aconitine dose/μg·kg－1 VPB VT VF Control 55.71 ±12.40 69.05 ±11.82 81.55 ±13.08 CCM 50 74.39 ±17.30* 98.55 ±20.44* 124.90 ±24.72*CCM 100 83.31 ±9.18＊＊ 113.10 ±11.21＊＊ 148.40 ±8.39＊＊CCM 200 91.86 ±9.30＊＊ 122.80 ±14.43＊＊ 154.80 ±9.69＊＊Lidocaine 20 99.36 ±10.52＊＊ 124.40 ±10.28＊＊ 152.00 ±11.01＊＊

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体。研究表明［3－7］，冬虫夏草对心血管系统有广泛的作用，如降血压、抗心律失常、抗心肌缺血缺氧、升高血小板和降血脂等。但由于受到以往提取工艺的限制，与西药相比，冬虫夏草对心血管的作用存在起效慢、效价低、服药量大、有效物质不明确、机制研究无法深入等缺点。本实验中所用的冬虫夏草提取物是采用现代提取分离纯化技术(专利号ZL 20061005250 9.6)和化合物结构鉴定技术，结合现代药理研究方法获得的，其物质组成明确，有利于进一步的药物作用研究。

Tab 3 Effect of CCM on ischemia-reperfusion induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

Tab 3 Effect of CCM on ischemia-reperfusion induced arrhythmia in rats(±s，n=8)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Group Dose/mg·kg－1 VT VF VPB(beat)Mortality/%Control 99.2 ±34.6 100 89.6 ±22.5 80 79.9 ±61.6 incidence/% duration/s incidence/% duration/s Arrhythmia score 80.0 ±13.3 20 CCM 50 72.8 ±21.7＊＊ 80 46.7 ±27.7＊＊ 50 10.9 ±20.4＊＊ 64.0 ±18.4* 0 CCM 100 21.8 ±14.9＊＊ 30 10.5 ±17.2＊＊ 20 2.3 ±5.0＊＊ 46.0 ±23.2＊＊ 0 CCM 200 10.9 ±7.2＊＊ 20 3.5 ±8.0＊＊ 10 0.6 ±1.9＊＊ 38.0 ±23.9＊＊0

心律失常是临床心血管系统疾病最常见的症状之一，由于心律失常发生机制复杂，目前没有一种单一的理想动物模型。本实验中采用了氯仿、乌头碱和缺血3种致心律失常的动物模型，观察CCM提取物对抗心律失常的作用。

本研究表明，CCM提取物具有预防氯仿诱导的心律失常作用。目前认为，氯仿诱发的室颤可能与氯仿刺激植物性神经释放神经递质或肾上腺髓质释放大量儿茶酚胺、继而激动肾上腺素 β受体有关［8－9］。β受体激动后可通过促进受体依赖性的胞内Ca2+大量释放，导致胞内Ca2+贮存库耗竭，后者触发细胞外Ca2+内流，最终使胞内钙超载而诱发心律失常。因此推测，CCM提取物可能通过抑制受体依赖性的细胞膜上的Ca2+通道而发挥抗心律失常作用。

实验同时表明，改良技术获得的CCM提取物能对抗乌头碱引发的心律失常。乌头碱引发心律失常主要是由于它能激活心肌细胞的快Na+通道，使Na+内流加速，从而促使细胞膜去极化;同时乌头碱还能提高心房传导组织和房室束－蒲肯野系统等快反应细胞的自律性，并诱发多源性异位节律点，缩短心肌不应期，最终导致心律失常［10－11］。本实验结果提示，CCM提取物可能通过抑制心肌细胞的快Na+通道而发挥抗心律失常的作用。

此外研究还发现，CCM提取物可降低缺血/再灌性心律失常的严重程度。本实验采用冠脉结扎制备缺血/再灌模型，由此诱发的心律失常其机制非常复杂，可能涉及到多个环节，如氧自由基聚集，酸中毒，交感神经兴奋引起胞内钙超载等，最终心肌细胞超微结构明显破坏、心功能受损，导致心律失常发生［12－13］。本实验结果提示，CCM 提取物可对抗缺血/再灌性心律失常，但具体机制还需进一步探讨。

对于心律失常药物治疗，临床上虽然有较多，但疗效均不理想，因此新型抗心律失常药的研发具有重要意义。从本实验的结果推测，改良技术获得的CCM提取物有较好对抗氯仿、乌头碱和缺血/再灌诱导的心律失常模型的作用，为该药临床上用于室性心律失常，尤其对交感中枢兴奋所致心律失常、由快反应细胞的自律性增高所致的心律失常提供了实验依据。同时其对急性心肌缺血有明显的保护作用，这为该药在临床上治疗急性心肌缺血性疾病提供了实验参考。本实验通过HPLC加量法，测量出本实验所用的CCM提取物中尿苷的含量为35%，而腺苷的含量为38.1%(重量百分比)。腺苷是人体内一种非常重要的内源性物质，能有效对抗肾上腺素和氯化钡等所致室性心律失常，减少大鼠心肌缺血/再灌后室颤的发生率，对心血管损伤中起着重要的保护作用［14－15］。这些活性成分是否是CCM发挥抗心律失常作用的主要成分还需进一步探讨。

综上所述，本实验模型为CCM提取物的进一步开发成为抗心律失常和防止心肌缺血损伤的纯中药制剂提供了可行性依据，值得临床进一步观察。

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