接骨木多糖对大鼠胰岛细胞增殖及胰岛素分泌的影响

宋琳亮，傅江南

(暨南大学医学院，广东 广州 510632)

忍冬科接骨木属Sambucus Linn.植物约20余种，多个国家都有将该属植物用作草药的记载［1－2］，疗效包括抗癌［3］、消炎［4］、利尿［5］及促进骨折愈合［6］等等。接骨木多糖(Sambucus polysaccharides，SP)是从接骨木茎中分离提取的活性成分，动物实验结果表明，接骨木多糖对于链脲菌素致糖尿病大鼠模型具有明显的降糖作用，同时血浆内高密度脂蛋白水平明显升高［7］。本研究将进一步采用体外培养研究接骨木多糖对胰岛细胞活性的影响及对四氧嘧啶致胰岛细胞损伤的作用，以及接骨木多糖对胰岛细胞分泌胰岛素功能的影响进行研究。

1 材料与方法

1.1 细胞INS-1E细胞由暨南大学实验动物管理中心馈赠。

1.2 主要试剂和仪器RPMI 1640、DMEM培养基均购自Gibco BRL公司;新生牛血清购自Hyclone公司;CCK-8细胞计数试剂盒购自日本Dojindo;大鼠胰岛素检测试剂盒购自Mercodia公司;其他试剂均购自Sigma。Bio-Tek ELX 800酶标仪(美国);REVCO CO2培养箱(美国)。

1.3 接骨木多糖的制备接骨木多糖提取自接骨木茎，提取流程简述为接骨木茎粉碎烘干—乙醚脱脂—热水浸提—抽滤—乙醇沉淀—离心分离—水溶解—脱蛋白脱色—旋转蒸发浓缩—DEAE Sepharose Fast Flow层析—穿过液冻干。

1.4胰岛细胞的培养INS-1E细胞在RPMI 1640培养液、5% 的CO2培养箱中培养，培养液中包含1 mmol·L－1丙酮酸钠、5.6 mmol·L－1萄萄糖、10%胎牛血清(FBS)、10 mmol·L－1HEPES、2 mmol·L－1L-谷氨酰胺、50 μmol·L－1β-巯基乙醇、100 U·ml－1青霉素和100 mg·L－1链霉素。接种密度为6×108·L－1，每2天更换1次培养基。

1.5胰岛细胞活性检测培养液中接骨木多糖浓度分别为 50、100、200、400、800 mg·L－1，在培养箱内培养，每天检测细胞活性，持续5 d。每孔加入10 μl CCK-8试剂，置细胞培养箱继续培养4 h后取出，用酶标仪测定450 nm吸光度，参比波长530 nm。

1.6接骨木多糖对四氧嘧啶致胰岛细胞损伤的影响将细胞分为阴性对照组、四氧嘧啶组和多糖组，培养48 h后，多糖组分别加入不同浓度的多糖溶液，使其终浓度分别为 50、100、200、400、800 mg·L－1，继续培养4 h，四氧嘧啶组和多糖组分别加入四氧嘧啶溶液，使其终浓度为4 mmol·L－1，细胞继续培养20 h，然后如上检测细胞活性。

1.7 接骨木多糖对胰岛细胞的促胰岛素分泌作用

对细胞进行分组:① 5.6 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;② 16.7 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;③ 4 mmol·L－1四氧嘧啶 +2.7 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;④ 4 mmol·L－1四氧嘧啶 +16.7 mol·L－1葡萄糖 ± 多糖;多糖溶液浓度分别为0、50、100、200、400、800 mg·L－1。培养24 h后，用Krebs-Ringer碳酸盐缓冲液(KRBB:129 mmol·L－1NaCl、4.8 mmol·L－1KCl、1.2 mmol·L－1MgSO4、1.2 mmol·L－1KH2PO4、2.5 mmol· L－1CaCl2、5 mmol· L－1NaHCO3、0.1%BSA 和10 mmol·L－1HEPES，pH 7.4)洗涤细胞，随后在KRBB缓冲液中加入葡萄糖、丙酮酸钠或氯化钾培养30 min。收集上清液，于－20℃冻存。

再用Hanks液洗涤3次，加入裂解液裂解细胞(50 mmol·L－1HEPES、0.1%(V/V)Triton X-100、1 mmol·L－1PMSF、10 mmol·L－1E-64、10 mmol·L－1pepstatin A、10 mmol·L－1TLCK、100 mmol·L－1leueptin，pH 8.0)，收集，于 －20℃冻存。用酶联免疫试剂盒(Mercodia AB Sweden)450 nm检测胰岛素浓度。

1.8统计学分析文中进行数据统计的试验数据重复均为6次。试验数据以±s表示。SPSS10.0软件进行统计分析，one-way ANOVA和邓肯氏新复极差检验进行组间数据的多重比较。

2 结果

2.1接骨木多糖对胰岛细胞活性的影响检测接骨木多糖处理后大鼠胰岛细胞增殖活性，结果发现(Fig 1)，在试验浓度范围(50 ～800 mg·L－1)内，处理组细胞增殖率明显高于对照组(P＜0.05)。从接骨木多糖处理后d 1～5，100 mg·L－1浓度对大鼠胰岛细胞增殖的促进作用最强，之后随着浓度增加，促进作用减弱。

Fig 1 Effects of Sambucus polysaccharides treatment in different concentrations on the cell viability in 5 days

2.2接骨木多糖对四氧嘧啶致胰岛细胞损伤的影响不同浓度接骨木多糖处理4 h后，在细胞培养液中加入4 mmol·L－1四氧嘧啶，诱导胰岛细胞损伤。四氧嘧啶作用20 h后，用CCK-8法检测细胞活性。如Fig 2所示，结果发现，与四氧嘧啶单独处理组相比，不同浓度(50～800 mg·L－1)接骨木多糖处理组都表现出了较高的细胞活性，其中100、200和400 mg·L－1处理组的细胞活性明显高于四氧嘧啶组(P＜0.05)，随着处理浓度增加，细胞活性增加，200 mg·L－1接骨木多糖浓度下的细胞活性最高，之后随着处理浓度增加细胞活性降低。

Fig 2 Effects of Sambucus polysaccharides treatment in different concentrations on the cell viability induced damage with alloxan

2.3接骨木多糖对胰岛细胞促胰岛素分泌作用的影响在处理组培养液中加入不同浓度的接骨木多糖，培养24 h后，再分别用低浓度葡萄糖和高浓度葡萄糖刺激大鼠胰岛细胞分泌胰岛素，检测胰岛素浓度。结果发现在5.6 mmol·L－1低糖条件下，与对照组相比50 mg·L－1接骨木多糖对胰岛素分泌没有明显影响，而其它4个浓度(100、200、400、800 mg·L－1)处理都明显降低了胰岛素释放量。而在16.7 mmol·L－1高糖条件下，50 mg·L－1接骨木多糖对胰岛素分泌没有明显影响，但其它4个浓度(100，200，400，800 mg·L－1)处理都明显增加了胰岛素释放量，200 mg·L－1和 400 mg·L－1两个处理组胰岛素释放最高(Tab 1)。

Tab 1 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in INS-1E cells(±s，n=6)

Tab 1 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in INS-1E cells(±s，n=6)

*P＜0.05 vs contorl

Group Dose/mg·L－1 Insulin secretion at different concentration glucose/mU·g－1Pro 5.6 mmol·L －1glucose 16.7 mmol·L －1glucose Control 12.49 ±0.38 50.63 ±2.35 SP 50 12.59 ±0.31 51.55 ±2.49 100 11.95 ±0.36* 59.01 ±2.95*200 10.88 ±0.41* 67.99 ±2.09*400 11.16 ±0.29* 66.31 ±4.03*800 11.04 ±0.14* 60.78 ±2.88*

Tab 2 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in alloxan damaged INS-1E cells(±s，n=6)

Tab 2 Influence of Sambucus polysaccharides on insulin secretion in alloxan damaged INS-1E cells(±s，n=6)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs alloxan

Group Insulin secretion at different concentration glucose/mU·g－1Pro 5.6 mmol·L －1 glucose 16.7 mmol·L －1 glucose Control 9.64 ±0.14 45.50 ±2.98 4 mmol·L －1alloxan 5.81 ±0.13* 25.44 ±2.37*50 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 5.99 ±0.09*# 26.71 ±1.69*100 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 6.94 ±0.10*# 28.22 ±1.91*#200 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 7.34 ±0.19*# 32.76 ±2.40*#400 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 7.57 ±0.11*# 31.74 ±1.43*#800 mg·L －1SP+4 mmol·L －1alloxan 7.00 ±0.20*# 30.95 ±1.39*#

再用四氧嘧啶诱导胰岛细胞损伤后，进行低糖和高糖刺激，检测各组胰岛素浓度。发现不论是高糖诱导组还是低糖诱导组，接骨木多糖预处理后胰岛素分泌量都高于四氧嘧啶组。

3 讨论

本研究分析了不同浓度接骨木多糖对胰岛细胞细胞活性和胰岛素释放的影响。结果表明，接骨木多糖可以促进INS-1E胰岛细胞增殖，并且该促进作用与浓度相关，在试验浓度范围内，100 mg·L－1浓度对大鼠胰岛细胞增殖的促进作用最强。四氧嘧啶对胰岛β细胞具有特殊的破坏作用，可以中止胰岛素分泌。本实验中，我们用四氧嘧啶处理接骨木多糖处理后的胰岛细胞，发现四氧嘧啶对胰岛细胞活性具有明显的抑制作用，可以损伤胰岛细胞，而接骨木多糖处理在一定程度上可以减轻这一损伤，其中以200 mg·L－1的作用效果最佳。

胰岛细胞可分泌胰岛素，胰岛素分泌降低表明胰岛细胞功能受损。研究结果发现，接骨木多糖可以抑制低糖诱导的胰岛素分泌，促进高糖诱导胰岛细胞分泌胰岛素。对于四氧嘧啶诱导的胰岛细胞损伤、胰岛素分泌减少，接骨木多糖也表现出了明显的抑制作用。这一结果与王丹蕊等［7］得到的动物实验结果相一致，表明接骨木多糖是通过调节胰岛细胞的胰岛素分泌功能达到降糖作用的。

接骨木多糖的具体作用机制需要深入研究，并对接骨木多糖结构进行测定和解析。

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［7］Wang D R，Shi J P.Study of the mechanisms of the effects of several plant polysaccharides on the streptozotocin induced diabetes rats［J］.J Chengdu Univ TCM，2002，26(3):22 －3.