调节性T细胞在骨破坏中的作用

孙传菊，李 霞，赵懿清，袁凤来，吴繁荣，陈飞虎

(1.南通大学第三附属医院药剂科，江苏 无锡 214041;2.安徽医科大学药学院，安徽合肥 230032)

骨骼作为运动中的动力器官，处在一个不断修复和重建过程。骨破坏是类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)和骨质疏松造成患者功能障碍等诸多临床问题的重要原因［1］。目前造成代谢性骨破坏的机制仍未完全阐明，但破骨细胞(osteoclast，OC)在其中的作用已被大量的研究所证实［2］，尤其是免疫系统在破骨细胞功能方面的研究进展，催生了骨免疫这一概念，并在此框架下取得了一系列研究成果［3－4］。

免疫细胞因子对破骨细胞在骨破坏中的调控发挥重要作用。已有研究证实［2］，细胞核因子κB受体活化因子配基(ligand of receptor activator of NF-κB，RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)在破骨细胞增殖、分化、活化和存活等一系列生理过程中起十分关键的作用。此外，白细胞介素1(interleukin 1，IL-1)、IL-17以及IL-7等细胞因子在破骨细胞增殖与分化等过程中发挥正调控作用［5］。除对破骨细胞正调控作用的免疫分子外，调节性T细胞(regulatory T cells，Tregs)是一群具有免疫抑制效应的T细胞亚群，对破骨细胞具有负调控作用，其调节功能在机体免疫自稳、移植耐受、肿瘤免疫、过敏反应及微生物感染方面均得到了证实［6］。由于其对破骨细胞的增殖与活化具有抑制功能，近年来备受关注。已有研究发现［7－8］，RA患者体内循环Tregs与患者局部和全身骨质破坏呈负相关，上调RA患者体内Tregs细胞，能够阻止或延缓患者的骨质破坏。

因此，本文就近年来有关Tregs及其在骨破坏研究中的进展情况作一综述，以期加深对骨破坏发病机制的认识，为抗骨破坏的治疗进一步打下基础。

1 Tregs的分类和来源

Tregs在体内外具有负性调节功能，根据Tregs表面标记、产生的细胞因子和作用机制的不同，Tregs可分为自然产生的CD4+CD25+Tregs(nTregs)细胞，在胸腺外诱导产生的适应性调节T细胞 (iTregs)两类［9－10］。

1.1自然产生的Tregs细胞近年来研究得较为清楚的亚型为CD4+CD25+Tregs细胞。研究证实［11］，nTregs细胞在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织中，约占CD4+T细胞总数的5%～10%。对nTregs来源，多数学者认为CD4+T细胞是在胸腺自然选择过程中产生的，其分化由T细胞受体(TCR)与胸腺皮质上皮细胞的MHC-Ⅱ类肽复合物或胸腺内皮细胞递呈的外周自身抗原肽间的高亲和力结合所诱导。nTregs在胎儿及新生儿早期CD4+T细胞发育过程中已有一定活性，细胞膜表达不同的TCR，具有识别各种抗原的能力［12］。在成人阶段，一些nTregs分化记忆CD4+T细胞，因此，即使胸腺随年龄增长而逐渐萎缩，但nTregs数量仍能保持在一定范围［13］。nTregs的免疫抑制性表现在经TCR介导的信号刺激活化以后能够抑制CD4+和CD8+T细胞的活化和增殖。

CD25(IL-2受体α链)是调节性T细胞的一个原始细胞表面标记［14］，此外，随着研究的深入，新的Tregs细胞表面标记不断被发现，研究提示糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子相关蛋白家族(glucocorticoid-induced TNF factor receptor-related family，GITR)、淋巴细胞活化基因-3(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)、CD127(IL-7受体)、神经纤毛蛋白-1(neuropilin-1，Nrp1)可能为 Treg 重要的表面分子标志物［15］。Foxp3基因属于Foxhead(forkhead box P3)转录因子家族，是细胞内分子。近年来的研究证明［16］，FoxP3对Tregs的生长及抑制功能均起关键作用，因此，FoxP3这一细胞内标志物对Tregs的鉴别有重要意义。

1.2诱导产生的Tregs细胞诱导型Tregs则由外周CD4+T细胞经抗原或细胞因子刺激后表达CD25而生成。iTregs细胞能够有效抑制其它T细胞的活化和增殖，而这些抑制作用可能是通过其分泌的IL-10和TGF-β等免疫抑制因子实现的［17］。到目前为止，根据iTregs分泌细胞因子的不同，将其分为Tr1(type 1 regulatory)和Th3(T-helper 3)两个主要亚基。Tr1主要分泌IL-10，而Th3主要分泌TGF-β，对Th1和Th2都具有抑制作用［18］。iTregs除表达FoxP3细胞内分子，还表达CD4、CD25、CTLA-4和GITR等细胞外分子。

2 Tregs对破骨细胞功能的抑制作用

破骨细胞是体内唯一吸收骨的多核细胞，它来源于造血细胞，经血液循环被招募到骨，在骨的微环境中分化为具有所有成熟破骨细胞表型的单核破骨细胞前体，然后融合成多核细胞。近期研究发现破骨细胞是RA和骨质疏松的骨破坏的关键，在骨破坏病灶部位有大量成熟OC及OC前体，活性淋巴细胞、巨噬细胞等多种起正调控作用的细胞因子，作用于OC生成、分化、活化和存活各个环节，使OC过度增殖或异常活跃，打破了骨代谢的平衡，骨破坏占据优势［19］。而负调控作用的免疫分子如Tregs细胞对破骨细胞介导的骨吸收也有抑制作用［20－22］。

Zaiss等［7］研究发现 Tregs细胞呈剂量依赖性抑制M-CSF和RANKL诱导的破骨细胞形成。进一步研究发现其抑制破骨细胞形成是通过自身细胞表面分子CTLA-4发挥作用的。此外，在体外用Tregs细胞能抑制破骨细胞骨吸收功能。Kim等［6］研究发现人血清中的Tregs抑制破骨细胞增殖与活化不是通过其细胞表面分子，而是自身分泌抑制性细胞因子IL-4和TGF-β。免疫磁珠方法分离其自身T细胞，在体外共同培养，并加入抗CD28和抗CD23抗体，增加Tregs细胞的生成，分化的破骨细胞明显减少，分泌的粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)、干扰素 γ (IFN-γ)、IL-5 和 IL-10 明显增加，从而免疫抑制破骨细胞增殖与活化。进一步研究发现，在体内将以上纯化的Tregs注入胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)小鼠关节，明显抑制脾细胞融合转化为破骨细胞。罗成燕等［21］研究发现Tregs源性IL-10与TGF-β1具有对破骨细胞分化及骨吸收的抑制作用。以上研究显示Tregs可能成为抑制破骨细胞增殖与活化的作用靶点。

3 Tregs在抗骨破坏中的应用

目前有关RA的实验动物模型，主要有CIA和抗原诱导的关节炎(antigen-induced arthritis，AIA)两类。Morgan 等［24］在研究小鼠CIA中发现，在Ⅱ型胶原免疫前除去小鼠Treg，小鼠CIA的发生率将大大提高，其疾病严重程度包括骨破坏也更高，而选择性回输Tregs细胞则可逆转CIA小鼠的病情。Zaiss等［25］将Foxp3转基因小鼠来源的骨髓细胞过继转至TNF转基因小鼠体内，结果发现，TNF转基因小鼠的骨质破坏几乎被全部阻断;而Foxp3基因敲除小鼠来源的骨髓细胞则能够加快TNF转基因小鼠的骨质破坏，其作用是Tregs直接抑制关节炎中破骨细胞的生成。在另一种实验小鼠模型(人TNF转基因小鼠)，给予CD28超拮抗性单克隆抗体(CD28 superagonist antibodies，CD28 SA)，能够刺激上调Foxp3的Tregs细胞数量，也能够明显抑制实验小鼠的骨质破坏(Fig 1)。在上述实验模型，由于破骨细胞前体细胞分化受阻，破骨细胞数量的减少，是Tregs抑制骨质破坏的主要原因。

Fig 1 Anti-CD28 superagonist antibody in the suppression of bone destruction

最近在骨质疏松的研究中发现［26］，过表达Foxp3的淋巴细胞，明显增加Tregs细胞数量，能明显增加骨形成而抑制去卵巢诱导的骨破坏。进一步研究发现，向淋巴细胞缺乏的RAG1基因敲除小鼠注入CD4+CD25+Tregs细胞直接抑制破骨细胞的形成和功能从而增加骨量和抑制骨破坏，不依赖于分泌其它抑制性细胞因子。

4 展望

总之，当前的研究表明Tregs细胞主要是通过抑制破骨细胞的功能而抗骨破坏。尽管目前对体内外Tregs细胞都已进行了广泛的研究并取得了重大进展，但关于Tregs的作用机制和免疫生物学特性以及其在骨破坏中确切的作用，尚未取得无争议的结论，因而仍需作更深入的研究。Tregs细胞在诱导抑制破骨细胞中的作用是肯定的，但是其确切的抑制骨破坏的作用机制，以及在临床使用中的安全性等问题，仍有待于深入的研究。不同的研究策略诱导Tregs细胞增殖的效力还需进行系统的评价，对这些问题的深入研究将有利于在临床使用中对Tregs细胞进行可靠的控制。我们完全有理由相信，随着研究的不断深入，必将使我们对骨破坏的发病机制有更准确的认识［27］，并有可能使Tregs在治疗RA和骨质疏松等骨破坏方面取得新的突破。

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