两种方法用于HPV基因检测的比较

王 攀 李招云 万卫昌 石英英

(台州市恩泽医疗集团中心医院,浙江 台州 318000)

宫颈癌的发生与HPV感染高度相关。有文献报道,HPV的感染率在宫颈上皮内瘤变(CIN)I中为70%～78%,在CIN II～III中为80%～89%,在宫颈癌中则超过95%[1],因此HPV的检测及在宿主癌变的预防中具有十分重要的意义,但如何在早期诊断子宫颈癌及癌前病变仍然是一个世界性的课题。目前,HC2技术是目前唯一被FDA批准在临床应用的HPV DNA检测方法[2],但在我国应用尚未普遍开展[3]。本文拟采用PCR结合反向杂交分析技术检测HPV DNA,与HC2技术相比较,从而评估PCR结合反向杂交分析技术在检测HPV感染筛查中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源 收集本院2009年3月～2010年5月门诊患者和体检健康者,共4252例,年龄18～69岁。

1.2 标本采集 用女性专用宫颈刷擦拭宫颈处,采集足够的阴道分泌物,取出后放入洗脱管中,沿折痕处将宫颈刷柄折断,旋紧洗脱管盖,做好样品标记,-20℃保存送检。

1.3 仪器和试剂 PCR结合反向杂交分析试剂为亚能生物技术(深圳)有限公司产品(可检测6、11、42 、43 、44 、16 、18 、31 、33 、35 、39 、45 、51 、52 、56 、58 、59 、66、68、73、83、MM423 种 HPV 基因型),HC2 试剂为美国 Digene 公司产品(可检测 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、6813 种 HPV 基因型),LITTLE GENIUS基因扩增仪(LIFE EXPRESS),分子杂交(Combi-H12型),超速低温离心机。

1.4 PCR结合反向杂交技术 操作按试剂盒说明书进行,主要有以下步骤:(1)DNA提取;(2)PCR扩增:扩增条件为 50℃15分钟、95℃10分钟,然后94℃30 秒 、42℃90 秒 、72℃30秒共 40 循环,再72℃5分钟延伸;(3)杂交;(4)洗膜;(5)显色。结果判断:根据膜条上蓝色斑点出现的相应位置即可判断HPV的亚型为阳性,反之为阴性。

1.5 HC2技术 操作按试剂盒说明书进行,主要有以下步骤:(1)DNA提取;(2)杂交;(3)捕获:第1抗体(特异性抗体)将RNA-DNA杂交复合物固定在微孔壁上;(4)信号放大:结合有碱性磷酸的多个第2抗体与RNA-DNA杂交复合物结合;(5)信号检测。阳性结果判断:检测样本的相对光单位(RlU)与标准阳性对照的RLU比值＞1.0。

1.6 统计学处理 所有数据用SPSS 10.0统计软件进行分析,比较平行试验结果用 χ2检验,检测结果间的一致性用K检验,比较PCR结合反向杂交技术与HC2技术的结果用 χ2检验。

2 结 果

2.1 平行试验结果 在364例样本中,PCR结合反向杂交技术高危型阳性率31.6%(115/364);HC2技术阳性率29.4%(107/364)。两种方法结果一致者326例,总符合率89.6%;不相符有 38例,其中PCR结合反向杂交技术检测阴性23例,阳性15例,HC2技术检测阴性15例,阳性23例。以HC2技术检测结果为标准,根据 χ2检验和K检验,χ2=1.7,Kappa=0.93,得P＞0.05,两者检测结果无显著性差异,见表1。

表1 PCR结合反向杂交技术与HC2技术检测HPV方法的比较

2.2 分开试验检测结果

2.2.1 PCR结合反向杂交技术结果 2561例临床标本中,其中HPVl3种高危型阳性者835例,阳性率32.6%。

2.2.2 HC2技术检测HPV DNA的结果 1327例临床标本中,共检出阳性标本407例,检出率为30.7%。

2.2.3 PCR结合反向杂交技术与HC2技术的结果比较,P＞0.05。两者检测结果无显著性差异。

3 讨 论

美国Digene公司的HC2技术是目前唯一获得美国FDA认证和推荐可在临床应用的HPV DNA检测技术,已在世界范围内用于HPV的筛查[3]。该法利用特异性的RNA探针和信号放大检测方法,可以半定量检测HPV病毒的DNA,并具有较高的灵敏度、特异性和重复性。但该法只能进行高危型和低危型的分类,不能进行基因型的分类,实验中还存在高危型探针可与低危型探针发生交叉反应,除可与自身检测的HPV类型外,还能够与其他类型的HPV反应[4]。并且其成本较高,操作复杂,耗时长,不适合我国国情。因此寻找一种简单、廉价、准确、快速、安全的检测方法用于HPV的筛查是非常有必要的。

本试验采用PCR结合反向杂交技术检测HPV DNA,该方法是将多种探针固定在一条膜上,参与检测的样品DNA互不干扰,故能同时筛查多种不同类型的HPV基因型。因此,不仅简化了检测程序,缩短检测时间,同时又能进行基因的分型。试验结果表明,同时使用PCR结合反向杂交技术与HC2技术检测364例标本,高危型阳性率分别为31.6%、29.4%,两者比较无显著性差异(P＞0.05),并具有良好的检验一致性;PCR结合反向杂交分析技术检测2561例标本,高危型阳性率为32.6%,HC2技术检测1327例标本,高危型阳性率为30.7%,两者比较无显著性差异。因此作者认为,PCR结合反向杂交技术同样具备较好的灵敏性、特异性和重复性。

本文由于条件有限未开展确证实验,故不能对两者检测的不同结果进行确证,无法得出PCR结合反向杂交结果的真阴性率和真阳性率。作者认为,理想的PCR结合反向杂交法的检测探针应使其Tm值的变动尽可能的小,环境和操作污染的干扰更少,更简化、完善检测程序,具备更高的检测灵敏性、特异性和重复性,使其更加适合应用于HPV DNA的临床检验。

[1] Munoz N,Bosch F X,De Sanjose S,et al.Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer.N Engl J Med,2003,348:518

[2] Shuhatovich O M,SharmanM P,Mirabal Y N,et al.Participant recruitment and motivation for participation in optical technology for cervical screening research trials.Gynecol Oncol,2005,99(3 Suppl 1):S226

[3] Lonky N M,Felix J C,Naidu Y M,et al.Triage of atypical squamous cells of undermined significance with hybrid capture II:colposcopy and histologic human papillomavirus correlation.Obstet Gynecol,2003,101:481

[4] 肖克林,王丁,周克元.HC2法在宫颈癌筛查中的应用现状.国际检验医学杂志,2008,29(4):364