COX-2介导MDR1/P-gp调控人结肠癌细胞多药耐药的研究

隋华 周利红 刘宣 殷佩浩 周宁 王炎 孙珏 范忠泽 李琦

上海中医药大学附属普陀医院肿瘤科，

上海中医药大学中西医结合肿瘤介入研究所，上海 200062

多药耐药(multidrug resistance，MDR)是影响结直肠癌临床化疗疗效的重要原因之一，结直肠癌产生多药耐药的机制较为复杂，其中多药耐药基因MDR1编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)在结直肠癌多药耐药中起着重要作用［1］。COX-2是花生四稀酸转化为前列腺素过程中的一个关键限速酶，是肿瘤发生、发展的重要分子靶标之一。有研究表明，COX-2过表达与结直肠癌多药耐药密切相关，是结直肠癌多药耐药重要的促进因素，但其确切的机制尚不清楚［2-3］。本实验采用含COX-2基因的重组慢病毒载体和COX-2特异性抑制剂上调或抑制人结肠癌敏感细胞HCT8和多药耐药HCT8/V细胞COX-2的表达，研究COX-2对人结肠癌细胞的化疗药物敏感性、MDR1 mRNA和P-gp表达的影响，探讨COX-2对人结肠癌细胞多药耐药的影响和调控作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂

人结肠癌细胞株HCT8及人结肠癌多药耐药细胞株HCT8/V由上海中医药大学附属普陀医院实验中心保存。载体质粒(pFU-GW)、pGCSIL-GFP质粒和293T细胞株购于上海博古生物公司；大肠埃希菌DH-5α为本实验室保存；限制性内切酶XbaⅠ、XhoⅠ、HpaⅠ、NotⅠ、T4 DNA连接酶、PrimeSTARTM HS DNA多聚酶均购自大连宝生物公司；脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自天根生物公司。COX-2特异性的抑制剂NS-398购于美国Serologllcais公司；四甲基偶氮唑盐MTT购自美国Sigma公司；总RNA抽提试剂RNAiso Reagent、荧光定量PCR试剂购于日本TaKaRa公司；GAPDH和MDR1上下游引物和探针由上海闪晶生物公司设计并合成。蛋白质抽提试剂盒(Sangon S-415)、BCA蛋白质定量试剂购于德国Merck公司；SDS-PAGE电泳试剂购自上海博彩生物技术有限公司；兔抗人P-gp单克隆抗体购自德国Merck公司。

1.1.2 仪器

Mastercyclerep银质梯度PCR仪、Biophotometer生物分光光度计、5804R高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；ABI7300实时定量PCR仪购自美国ABI公司；CKX41/U-RFLT50荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司；Chemidox化学发光成像仪购自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人结肠癌HCT8细胞在37 ℃，CO2体积分数为5%，饱和湿度，含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中常规培养，多药耐药HCT8/V细胞在上述培养体系基础上加入终浓度为2 μg/mL的长春新碱(VCR)以维持耐药性，细胞每1～2天传代1次，取对数生长期的细胞用于实验。

1.2.2 MTT实验

取对数生长期人结肠癌敏感细胞株HCT8和耐长春新碱细胞株HCT8/V，分别调整细胞浓度至1×105mL-1，以每孔100 μL接种于96孔细胞培养板中，在CO2体积分数为5%、饱和湿度、37 ℃孵箱中常规培养。待细胞贴壁3～5 h后，除对照组外各自加入含不同浓度化疗药物的培养基100 μL，每组设4个复孔。培养48 h后每孔加入MTT(5 mg/mL)20 μL，37 ℃温育4 h后弃上清液，加入150 μL DMSO，震荡混匀使MTT还原产物充分溶解后，酶标仪检测570 nm波长处吸光度D值。计算细胞的生长抑制率和耐药指数(resistance factor，RF)。计算公式：生长抑制率=(1-D实验组均值/D对照组均值)×100%；RF=某种药物针对抗药性细胞的IC50/某种药物针对敏感性细胞的IC50。以上实验重复3次。

1.2.3 COX-2-GFP-Lentivirus重组慢病毒载体的构建并感染人结肠癌细胞

⑴慢病毒载体的构建和鉴定 将慢病毒pFU-GW进行AgeⅠ酶切，线性化处理，1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切片段，并回收条带。将COX-2基因PCR产物交换进入线性化慢病毒载体，加入的线性化载体DNA和纯化的PCR产物的摩尔数比例为1∶3～1∶9之间，设置阳性对照和自连对照。将构建好的载体转化入大肠埃希菌DH5α，长出克隆后进行PCR鉴定，鉴定阳性结果进行测序。⑵重组慢病毒包装 取对数生长期细胞293T细胞，按照每孔1.2×106个细胞接种。转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基，待细胞70%融合时分别将慢病毒表达载体与pGCSIL-GFP质粒混匀，加入250 μL OPTI-MEM去血清培养液，并用LipofectamineTM2000共转染于相应的293T细胞组中。转染后48 h后可置于荧光显微镜下观察两组细胞绿色荧光蛋白的表达情况，确定包装成功。72 h后收集上清液，3 000 r/min离心(半径10 cm)20 min，并经0.45 μm滤膜过滤后，将病毒上清液保存于-80 ℃下备用。⑶孔稀释法测定病毒滴度 将病毒储存液按梯度稀释至(10-1～10-3)，依次取10 μL加到细胞中，放入37℃，CO2体积分数为5%的培养箱中培养。48 h后更换培养液，3～4 d后观察荧光表达。正常情况下，荧光细胞数随稀释倍数增加而相应减少，计数最大稀释倍数孔中的带有荧光的细胞个数，病毒滴度(TU/mL)=(荧光细胞个数×转染时细胞数/100×每孔加入病毒稀释液体积)×100%/稀释浓度。⑷COX-2-GFP-Lentivirus重组慢病毒载体感染人结肠癌细胞 将人结肠癌HCT8和多药耐药HCT8/V细胞分为3组：⑴空白对照组：HCT8和HCT8/V结肠癌细胞株；⑵阴性重组慢病毒组：分别进行阴性慢病毒GFPLentivirus感染；⑶COX-2重组慢病毒组：分别进行过表达COX-2重组慢病毒COX-2-GFPLentivirus感染。感染前2 d以胰酶消化HCT8和HCT8/V细胞，接种于24孔板，每孔计数(1～3)×105个细胞，当细胞长至50%的培养基面积时用于感染。将病毒原液稀释1×106溶于5 mL培养基，100 μL LipofectamineTM2000溶于5 mL培养基。混合后20 min，缓慢加入HCT8和HCT8/V细胞中。24 h后将培养液换为含血清的RPMI 1640培养基培养。感染48 h后，将培养板中的细胞按1∶10比例接种，感染72 h后开始加130 μg/mL的Zeocin进行筛选，出现阳性克隆后，以100 μg/mL维持筛选15 d。

1.2.4 Real-time PCR实验

按照表1中的序列设计内参基因GAPDH和目的基因MDR1的引物和探针，用RNAiso试剂分别提取细胞总RNA，并逆转成cDNA，按Real-time PCR试剂盒方法以进行荧光定量PCR反应，体系(20 μL)如下：Premix EX TaqTM 10 μL，Rox Reference Dye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，荧光探针0.8 μL，dH2O 6 μL，cDNA 2 μL，反应条件： 95 ℃预变性10 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸31 s，40个循环，数据采用ABI 7300 SDS Software分析。相对mRNA表达水平按以下公式计算：相对mRNA表达量=2-△Ct，△Ct=Ct靶基因- CtGAPDH。

1.2.5 Western blot实验

收集对数生长期各组细胞约2×106/组，用预冷PBS洗涤2次，吸弃PBS，加入预冷的蛋白裂解液在冰上裂解0.5 h，14 000×g离心15 min，吸弃上清液；BCA分析试剂测定蛋白质浓度。50 μg总蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳，PVDF膜转膜，5%脱脂奶粉封闭非特异性抗体，然后分别加入1∶1 000鼠抗人COX-2抗体，4 ℃过夜。次日用TBS/T洗膜3次，再加入HRP标记的二级抗体，室温温育1 h，ECL显色。β-actin作内参对照，分析灰度值进行计算灰度系数比。

1.3 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件包处理数据。各组数据采用表示，两独立样本均数比较，采用Independent-samplestTest，多样本均数比较采用单因素方差分析，均数间两两比较采用SNK-q检验(Student-Newman-Keuls法)，计算组间差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

表 1 实时荧光定量PCR检测所需MDR1和GAPDH引物序列Tab.1 RFQ-PCR primers and Taqman probes sequences of MDR1 and GAPDH

2 结 果

2.1 人结肠癌细胞对多种化疗药物的敏感性

不同浓度的化疗药VCR、DDP、5-FU、THP对人结肠癌HCT8细胞48 h的IC50值分别为(18.2±7.1) μg/mL、(10.2±0.8) μg/mL、(7.5±0.8) μg/mL和(7.6±0.9) μg/mL；而对多药耐药HCT8/V细胞48 h的IC50值分别为(191.1±18.2) μg/mL、(290.8±28.4) μg/mL、(23.1±2.0) μg/mL和(26.4±2.9) μg/mL，HCT8/V细胞的耐药指数分别为10.49、28.37、3.09和3.47，与HCT8细胞相比，HCT8/V细胞细胞具有明显的多药耐药性(P＜0.01，表2)。

表 2 4种化疗药物对HCT8和HCT8/V敏感性的影响Tab.2 Effect on cytotoxicity of 4 chemotherapeutic drugs in HCT8 and HCT8/V cells

2.2 稳定高表达COX-2的细胞株克隆

携带有COX-2基因的重组慢病毒载体COX-2-GFP-Lentivirus感染人结肠癌HCT8和HCT8/V细胞后发出亮绿色的GFP荧光，荧光显微镜观察48 h的感染率＞80%(图1)。

2.3 COX-2-GFP-Lentivirus对人结肠癌细胞COX-2表达的影响

含COX-2基因的重组慢病毒表达载体(COX-2-GFP-Lentivirus)感染人结肠癌HCT8和HCT8/V细胞后，提取细胞总蛋白进行Western blot检测COX-2蛋白表达。结果显示，感染含COX-2基因的重组慢病毒后，HCT8细胞内COX-2表达显著上升，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，而HCT8/V细胞由于基础表达量较高，与对照组相比COX-2表达增加不明显(图2)。

2.4 COX-2对人结肠癌细胞化疗药物敏感性的影响

感染COX-2-GFP-Lentivirus后，人肠癌HCT8细胞对VCR对的IC50值从(18.2±7.1)μg/mL上升为(122.5±13.4)μg/mL，差异具有统计学意义(t=11.9，P＜0.01)；而抑制HCT8细胞COX-2后，细胞对VCR的敏感性无明显变化。感染COX-2-GFP-Lentivirus后HCT8/V细胞对VCR的敏感性无明显变化(P＞0.05)；而用NS-398(20 μmol/L，2 h)抑制HCT8/V细胞COX-2表达后，VCR对HCT8/V细胞的IC50值从(191.1±18.2) μg/mL下降到(32.2±7.5)μg/mL(t=14.0，P＜0.01，图3)，提示调控COX-2的表达可以调节结肠癌细胞对化疗药物的敏感性。

2.5 COX-2对人结肠癌细胞MDR1 mRNA表达的影响

RFQ-PCR检测结果显示，HCT8/V细胞的MDR1 mRNA表达明显高于HCT8细胞，两者相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。感染COX-2-GFP-Lentivirus后，与对照组相比，HCT8细胞MDR1 mRNA表达明显增加(P＜0.01)；而抑制COX-2表达后(NS-398，20 μmol/L，2 h)，HCT8/V细胞MDR1 mRNA表达下降了53.3%，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.01，图4)。

2.6 COX-2对人结肠癌细胞P-gp表达的影响

Western blot结果显示，人结肠癌多药耐药HCT8/V细胞P-gp表达明显高于HCT8细胞。感染COX-2-GFP-Lentivirus后，HCT8细胞P-gp表达明显增加，与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.01)。而抑制COX-2(NS-398，20 μmol/L作用2 h)后，HCT8/V细胞P-gp表达下降了42.5%，差异具有统计学意义(P＜0.01)。提示COX-2可以上调结肠癌HCT8细胞的P-gp表达，而抑制COX-2表达则可降低HCT8/V细胞的P-gp表达，说明COX-2能够调控结肠癌细胞P-gp的表达(图5)。

3 讨 论

多药耐药是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，不仅对此种化疗药物产生耐药性，而且对其他结构和功能不同的抗肿瘤药物也产生交叉耐药性的现象，是造成化疗失败的主要原因［4］。有研究表明，结直肠癌是MDR1/P-gp表达水平及频率最高肿瘤之一［5］。当药物进入细胞后，P-gp结合药物分子，同时其ATP位点结合ATP后释放能量，使药物转运到细胞外，同时也可直接从细胞膜排除药物，使细胞内药物浓度始终维持在低水平，细胞由此产生耐药。因此，针对P-gp调节的研究，是目前逆转结直肠癌细胞多药耐药、提高化疗敏感性、减少结直肠癌化疗失败的重要途径［6］。

研究发现，COX-2与MDR1/P-gp等耐药相关基因关系密切，可调节肿瘤细胞MDR基因的表达［7］。COX-2为诱导型合酶，静息时不表达，当细胞受到各种诱导因子刺激时可迅速合成，是炎症过程中一个重要的诱导酶，并参与肿瘤的发生及发展，可作为炎症及肿瘤的一个重要的治疗靶分子［8-10］。临床研究显示，结肠癌组织中COX-2蛋白呈高表达，其表达量较其周围的正常黏膜有显著增强，是结肠癌发生、发展、侵袭的重要致癌因子［11］。

有研究发现，在消化道肿瘤中，COX-2的表达与MDR1/P-gp具有明显正相关性，并且抑制COX-2的活性可以降低MDR1/P-gp介导的多药耐药［12］。Zatelli等［13］研究证实，NS-398可抑制乳腺癌rMCF7细胞内P-gp的表达，提高其对化疗药物的敏感性。本实验发现抑制COX-2表达能使HCT8/V细胞对化疗药物更加敏感，降低细胞的耐药性而增加化疗药物对细胞的杀伤作用；进一步研究证实COX-2的下调会直接降低HCT8/V细胞的MDR1 mRNA和P-gp的水平。说明COX-2可能通过降低MDR1的表达，影响P-gp的药泵功能从而引发多药耐药的。此结果与Zrieki等［14］在人结肠腺癌Caco-2细胞中的发现相一致。

与传统过表达质粒载体系统相比，慢病毒载体系统具有感染效率高、基因表达稳定、不易引起免疫反应等优点［15-17］。本研究结果发现上调COX-2的表达可以增强HCT8细胞对化疗药物的耐药性，与Miller等［18］的研究结果相一致。说明COX-2基因可以诱发敏感细胞向耐药细胞的转变，降低正常肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。为了更进一步证实这种想法，我们采用RFQ-PCR、Western blot检测细胞被COX-2-GFP-Lentivirus干预后MDR1 mRNA、P-gp的表达，结果发现：上调COX-2表达后，HCT8细胞的MDR1/P-gp表达明显升高，提示COX-2可以引起肿瘤的多药耐药现象的发生，其机制可能是通过介导MDR1/P-gp的表达实现的。

综上所述，本研究结果显示，上调COX-2的表达具有明显增加HCT8细胞耐药性的作用，抑制COX-2可降低HCT8/V耐药细胞MDR1 mRNA、P-gp的表达，从而逆转多药耐药。这为以后深入探讨COX-2对人结直肠癌多药耐药现象的发生、发展提供实验依据。

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