CIK治疗前后肿瘤患者外周血CD4+CD25+调节型T细胞变化研究

李 敏,邓海峰,陆明洋,徐 斌,郑 晓,刘 检,吴 骏,季 枚,周 怡,孙 青,吴昌平,蒋敬庭

(苏州大学附属第三医院肿瘤生物诊疗中心,江苏常州213003)

肿瘤局部存在多种类型的免疫抑制性细胞,它参与肿瘤患者的细胞免疫与肿瘤的发生、发展密切相关。其中 CD4+CD25+T细胞(regulatory T cell,Treg)是一类具有独特免疫调节功能的T淋巴细胞亚群,一般占人外周血CD4+T细胞的5%-10%[1,2]。近年来,国内外对这类调节性T细胞的研究已从自身免疫耐受、移植免疫逐渐扩展到肿瘤免疫,认为CD4+CD25+调节型T细胞是形成肿瘤免疫耐受的关键成分[3]。由细胞因子激活的杀伤细胞(Cytokine-induced killer cells,CIK)是可直接杀伤肿瘤细胞的一类新型抗肿瘤效应细胞,并且可调节和增强机体的免疫功能。本课题组曾系列报道了胃癌患者采用化疗联合CIK细胞治疗后机体的肿瘤标志物水平、细胞免疫功能变化、近期疗效观察及副反应等[4-8]。

我们利用流式细胞仪检测了28例肿瘤患者外周血CD4+CD25+调节型T细胞的表达,分析肿瘤的发生与CD4+CD25+调节型T细胞表达的关系,评价CD4+CD25+调节性T细胞在肿瘤的免疫抑制方面所起的作用。同时观察经CIK治疗后患者CD4+CD25+调节型T细胞表达的变化,为评估CIK细胞治疗及寻求新的免疫治疗途径提供思路。

1 材料与方法

1.1 研究对象 临床确诊的中晚期肿瘤患者28例(肿瘤组),胃癌18例,结肠癌4例,原发性肝癌4例,乳腺癌 2例。男20例,女8例;平均年龄(60±9)岁。CIK治疗一个疗程后3个月采外周血检测。选择健康成年人30例为对照,男15例,女15例,平均年龄(51±10)岁。

1.2 仪器及主要试剂 流式细胞仪EPICS XL(美国贝克曼库尔特公司),鼠抗人单克隆抗体CD4-PE,CD25-PC5,CD3FITC/CD56-PE,CD3-FITC/CD8PE及IgG1同型对照抗体(苏州基因生物技术有限公司)。基因重组人白细胞介素2(rhIL-2)(山东泉港药业有限公司);基因重组γ干扰素(IFN-γ)(上海克隆生物高技术有限公司);淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);RPMI 1640(美国GIBCO公司)。

1.3 CIK细胞的制备及回输 分离外周血PBMC用含 10%人AB血清、25 mmol/L HEPES、2 mmol/L谷氨酰胺的RPMI 1640调至起始密度2.0×106/L。于第 0天加入 1 000 U/ml γ-IFN,置于 37℃5%CO2培养箱培养,24 h后加入rhIL-1α 100 U/ml,CD3McAb 50 ng/ml,rhIL-2 800-1 000 U/ml继续培养。以后根据培养情况添加含 rhIL-1α100 U/ml,CD3McAb 50 ng/ml,rhIL-2 800-1 000 U/ml的RPMI1640完全培养液,并调整细胞密度为2×106/ml。CIK细胞培养至14-28天,取少许培养细胞做流式细胞仪检测,当CD3+CD56+细胞数≥50%,CD3+CD8+细胞≥30%且细菌及真菌培养阴性时即收集细胞。经生理盐水洗涤3次,加入1%人血白蛋白生理盐水中回输。一般为隔天回输一次,一个疗程共回输5次,回输细胞总数为1.6×1010以上。

1.4 FCM标本的制备及检测 取肝素抗凝外周血100 μ l,分别加入荧光标记的抗体各 10 μ l,4℃避光孵育30 min,加入溶血素 500 μ l混匀,室温溶血15 min,离心弃上清后各加入2 ml PBS洗涤2遍,最后加入500 μ l PBS混匀,10 min后上机检测。

1.5 统计学分析 采用SPSS13.0统计软件进行数据统计分析。各组检测结果以±s表示,组间差别采用t检验进行统计学差异性分析,以 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组与正常对照组外周血 CD4+CD25+T细胞表达流式分析 分别为(9.30±2.99)和(6.43±2.45)均明显高于正常对照组(5.01±1.69)(P＜0.05)。见图1。

图1 流式细胞检测CIK治疗前后肿瘤组与对照组外周血CD4+CD25+T细胞表达

2.2 肿瘤患者在 CIK治疗前及治疗后其外周血CD4+CD25+T细胞表达 CIK治疗前后肿瘤患者CD4+CD25+T细胞表达分析如表1所示,CIK治疗后患者外周血CD4+CD25+T细胞表达明显低于治疗前,其差别有统计学意义(P＜0.05)。

CIK治疗前后肿瘤患者外周血CD4+CD25+T细胞表达变化与患者性别无关;治疗前年龄较低(41-60)组患者外周血CD4+CD25+T细胞表达低于年龄较高(61-80)组,而治疗后两年龄组间差异无统计学意义。

表1 CIK治疗前后肿瘤组与对照组外周血CD4+CD25+T细胞表达测定

3 讨论

Treg在体内具有很强的免疫抑制作用,清除肿瘤患者体内的Treg有望改善患者的免疫功能。大量研究表明,在众多肿瘤患者外周血淋巴细胞中均有CD4+CD25+T细胞增多[9]。CD4+CD25+T细胞能够通过CTLA-4依赖的直接细胞接触抑制方式和分泌抑制性细胞因子如TGF-β或IL-10来抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的活化和增殖及分泌IL-2的能力[10,11]。由于CD4+T细胞和CD8+T细胞亚群是机体抗肿瘤免疫应答过程中的主要效应细胞,因此CD4+CD25+T细胞的免疫抑制功能导致肿瘤局部或循环中T细胞功能紊乱从而抑制了肿瘤患者的抗肿瘤细胞免疫应答。由此可以认为CD4+CD25+T细胞比例增加成为导致肿瘤患者细胞免疫功能削弱的机制之一。

研究表明,移植白血病细胞之前输入去除CD25+T细胞的脾细胞悬液,大多数BALB/C裸鼠生长肿瘤在一月内自行消退,并且能长期生存。在第二次大剂量移植白血病细胞后,该裸鼠排斥肿瘤细胞的反应更快更激烈,说明它们产生了肿瘤特异性CTL。Steitz等研究发现,在体内去除CD25+T细胞可产生两种效应细胞,一种为CD8+CTL,其作用是抗原特异性的;另一种是CD4-CD8+T细胞,如NK细胞,无须抗原刺激而起作用,共同激发有效的肿瘤免疫。与此相似,在体外无瘤刺激环境中培养去除CD4+CD25+T细胞的脾细胞悬液,也能诱导上述两种细胞的产生。在B16黑色素瘤小鼠中,通过抗CD4抗体,去除CD4+T细胞可使肿瘤生长迟缓,由此可以推测CD4+CD25+T细胞比例的升高可能是肿瘤特异性免疫下调的关键。

CIK细胞是人外周血单个核细胞在体外经多种细胞因子刺激后获得的一群异质细胞,它具有增殖能力强、杀瘤活性高和杀瘤谱广、临床应用副作用小的特点,是肿瘤过继免疫治疗中更为有效的杀瘤效应细胞。CIK细胞是一种非MHC(组织相容性抗原)和非T细胞受体限制性的免疫活性细胞,其主要效应细胞为CD3+CD56+细胞。为进一步了解肿瘤患者的免疫功能以及CIK细胞治疗对肿瘤患者免疫功能的影响,本研究对28例肿瘤患者经CIK细胞治疗前后,其外周血CD4+CD25+T细胞比例进行检测,结果显示:相对于健康者,肿瘤患者外周血中CD4+CD25+T细胞表达率显著增高。这一结果表明,在肿瘤患者中CD4+CD25+T细胞发挥了免疫抑制作用,从而使机体不能很好发挥抗肿瘤免疫应答作用,这在一定程度上进一步加速了肿瘤的发展。在经过CIK细胞治疗后,肿瘤患者外周血中CD4+CD25+T细胞比例较治疗前明显降低,但仍高于健康者。由此可见,CIK细胞治疗可以在一定程度上提高患者的免疫功能。但是,尽管治疗后患者的细胞免疫抑制状态得到了一定程度的解除,免疫功能逐步得到改善,机体处于一种活跃的免疫状态中,但患者的免疫状态仍然低下。因此,如何在更大程度上消除CD4+CD25+T细胞对患者免疫功能抑制的影响,成为肿瘤生物治疗中一个需要重点解决的问题。

总之,随着对CD4+CD25+T细胞研究的进一步深入,通过特异性或非特异性清除Treg、控制Treg的数量和功能等开展肿瘤免疫治疗必将为肿瘤免疫治疗提供更多的策略。

作者简是:李敏,女,33岁,硕士,助理研究员,研究方向:肿瘤生物治疗。

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