热休克蛋白HSP27和HSP70在老年性白内障患者晶状体上皮细胞中表达及其意义

李桂荣,周鸿雁,张文松*

(1.吉林大学第二医院眼科医院,吉林长春130041;2.吉林大学中日联谊医院眼科)

近年来,热休克蛋白(heat shock protein,HSPs)对细胞的保护作用以及在细胞凋亡的调节方面受到了广泛的关注。但在晶状体中的研究较少。我们利用RT-PCR方法观察了HSPs的两种类型:HSP70和HSP27基因在老年性白内障和正常人晶状体上皮细胞中的表达情况,以探讨这两个基因与老年性白内障发生的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验组为北京朝阳医院2005年老年性白内障患者晶状体的前囊膜,共42眼(男26眼,女16眼)均为不同年龄的老年性白内障,平均年龄63.4岁±8.2岁,实验的对照组为健康成年眼球晶状体的前囊膜,共15例,为青壮年。

1.1.2 主要试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、dNTPs(10 mM)、Taq 酶(2 U/μ l)、β-Actin(25 pmol/μ l)。均为北京鼎国生物技术有限公司的产品。

1.1.3 引物 从PUBMED/Nucleotide GenBank中查出人HSP70、HSP27基因全序列,β-actin序列作为内参照。应用Primer Premier 5.0设计引物。

引物由北京奥科生物公司合成。序列如下:HSP70 上 游 引 物 :5′-GTACAGAAAGACATTAAAAAT-3′,下 游 引 物 :5′-TCAGGGTCGAATAAAGTTACT-3′。扩增产物长度为 200 bp。HSP27上游引物:5′-GCGAATTCCCTGCTAAAAATACCCGACT-3′;下 游引 物 :5′-GCAGCTGGATGCCCACCCCTGC-3′。扩增产物长度为 295 bp。 β-actin 上 游 引 物:5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′;下 游 引 物:5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。扩增产物长度为506 bp。

1.2 方法

提取两组晶状体前囊膜中总RNA,并以此逆转录成cDNA。

以β-actin作为内参,将其与待测得目的基因同时扩增,分两管相同体系进行。按PCR试剂盒说明书操作。

琼脂糖电泳分别取两管反应管中5 μ l扩增产物和上样缓冲液0.3 μ l点样后90 V电泳1 h,凝胶用紫外凝胶成像系统观察,并进行半定量分析。图像分析仪测照片上扩增产物的平均灰度,计算出其基因表达量与其对应的内参β-actin表达量的比值。

1.3 统计学处理

应用SPSS11.0软件包进行统计分析,各组两两比较采用方差分析,取P＜0.05为显著性差异。

2 结果

2.1 HSP27mRNA在老年性白内障与正常对照的LECs的表达情况

HSP27mRNA在老年性白内障与正常对照的LECs的表达如图1所示,HSP27基因和内参β-actin分别扩增基因片段。1-5为老年性白内障晶状体上皮细胞的HSP27基因的扩增产物,6-7为正常对照的晶状体上皮细胞的HSP27基因的扩增产物。老年性白内障中HSP27基因扩增的产物为295 bp,β-actin扩增的产为506 bp。图像分析仪测琼脂糖凝胶上HSP27/β-actin扩增产物的平均灰度,其基因表达量与其对应的β-actin表达量的比值,老年性白内障组为0.418±0.275,正常晶状体前囊膜组为0.147±0.006,两组比较差异有显著性(P＜0.01)。

图1 HSP27mRNA在老年性白内障与正常对照的LECs的表达情况

2.2 HSP70mRNA在老年性白内障与正常对照的LECs的表达情况

HSP70mRNA在老年性白内障与正常对照的LECs的表达如图2所示,1-2为老年性白内障晶状体上皮细胞的HSP70基因的扩增产物,3-5为正常对照的晶状体上皮细胞的HSP70基因的扩增产物。老年性白内障中HSP70基因扩增的产物为200bp,βactin扩增的产为506 bp。图像分析仪测琼脂糖凝胶上HSP70/β-actin扩增产物的平均灰度,其基因表达量与其对应的β-actin表达量的比值,老年性白内障组为0.80±0.14,正常晶状体前囊膜组为0.38±0.01,两组比较差异有显著性(P＜0.01)。

图2 HSP70mRNA在老年性白内障与正常对照的LECs的表达情况

3 讨论

近年来的研究表明,晶状体能表达一系列的热休克蛋白(HSPs)。它们对维持晶状体的稳定和透明起到关键作用[1]。其中HSP70,HSP27与白内障关系最为密切。

HSP70在正常细胞中水平较低,而在应激后表达显著增高。Li等研究显示HSP70通过抑制线粒体细胞色素C的释放及Caspase-3的活化而抑制细胞凋亡[2]。Dean等[3]的研究认为,正常的生理环境,例如光照等,对于晶状体来说亦是一种特殊的应激状态,可以诱导HSP的产生。HSP 70的表达增加有利于晶状体细胞内蛋白质的正确构象,维持晶状体的透明性,延缓和减轻白内障的发生。

HSP27是小分子热休克蛋白家族中重要的一员,广泛存在于人类细胞中,对维持晶状体的透明性有重要意义。其功能主要表现在分子伴侣功能:阻止蛋白间不必要的相互作用;帮助变性蛋白重新折叠[4]。此外,对损伤细胞具有修复及保护作用[5],通过Fas/APO1受体参与细胞凋亡[6]。近年来,HSP27在晶状体中的研究日益受到重视。Hawse等[7]在镉、铜等有害金属的作用下,应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)对热休克蛋白基因进行检测,结果发现晶状体上皮细胞的α-B晶体蛋白,HSP27等小分子热休克蛋白表达增高,推论HSP27对金属诱导的应激反应具有细胞保护的作用。

老年性白内障是最为常见的白内障类型,多见于50岁以上的中老年人,随年龄的增加其发病率升高。它是晶状体老化后的退行性变,是多种因素作用的结果。本实验研究了42例老年性白内障患者与15例正常对照眼,其晶状体前囊膜上皮细胞均发现了HSP的表达,但其表达量不同。老年性白内障患者HSP27、HSP70mRNA表达较正常对照组高,且两者之间的差异达到了显著水平(P＜0.05)。通过本研究,可以得出,HSP27、HSP70在老年性白内障的发生和发展中起了重要的作用,为老年性白内障的预防与临床治疗提供了理论依据。

[1]Berry Y.Alpha-B crystalline gene(CRYAB)mutation causes dominant congenital posterior polar cataract in human[J].Am J Hum Genet,2001,69:1141.

[2]Li CY,Lee JS,Ko YG.Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome C release and upstream of Caspase-3 activation[J].J Biol Chem,2000,275(5):25665.

[3]Dean DO,Kent CR,Tytell M.Constitutive and inducible heat shock protein70 immunoreactivity in the normal rat eye[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,1999,40:2952.

[4]Haslbeck M.Recombinant expression and in vitro refolding of the yeast small heat shock protein Hsp42[J].Int J Biol Macromol,2006,38(2):107.

[5]Krueger-Naug AM,Emsley JG,Myers TL,et al.Injury to retinal ganglion cells induces expression of the 8iIl-heat shock protein Hsp27 in the rat visual system[J].Neurescience,2002,110(4):653.

[6]张书霞,华荣虹,鲍恩东.热应激对鸡胸腺细胞凋亡的影响及其调节机理[J].南京农业大学学报,2003,26(1):66.

[7]Hawse JR,Cumming JR,Oppermann B,et al.Activation of metallothioneins and alpha-crystallin/HSPs in human lens epithelial cells by specific metals and the metal content of aging clear human lenses[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2003,44(2):672.