外周组织损伤对脊髓AMPA受体突触表达的影响及其机制

刘燕妮，索占伟，杨 娴，时 蕾，曹 静，李 帅，许英明，杨鸿斌，胡晓东

(兰州大学药学院分子药理研究所，甘肃兰州 730000)

AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)型谷氨酸受体介导神经系统中绝大部分的快反应兴奋性突触传递。在脊髓背角，生理性痛刺激通过初级传入纤维，向脊髓释放谷氨酸，激活突触后AMPA受体，促进痛觉信息向更高级的中枢传递。而当外周组织或神经损伤之后，脊髓AMPA受体的功能会明显升高，AMPA受体介导的兴奋性突触传递发生持久性的可塑性变化，最终导致慢性病理性疼痛的形成。

资料显示:AMPA受体的功能异常，与AMPA受体在突触中的表达数目、以及AMPA受体的亚基构成(subunit composition)密切相关［1］。在成年动物，脊髓背角AMPA受体主要是由GluR1、GluR2、GluR3亚基组合形成的四聚体，其中最常见的受体由2个GluR2和2个 GluR1、或者是2个 GluR2和2个GluR3所组成。GluR2作为构成AMPA受体的关键组分，不仅能够通过细胞内的突触输送(synaptic trafficking)过程，调节AMPA受体的突触含量，而且决定着AMPA受体的一系列生理生化特征，如AMPA受体的钙通透性、内向整流特性等。已有研究提示:GluR2可能参与慢性炎性疼痛过程［2］。但外周组织损伤是否直接调节脊髓GluR2的突触表达而促进中枢敏感化的形成，至今尚不清楚。

为探讨AMPA受体在突触中的表达变化与炎性疼痛形成的关系，本研究建立完全弗氏佐剂(CFA)炎性疼痛模型，观察GluR2亚基在脊髓突触中的变化，并分析慢性炎性疼痛中的一个关键激酶——cAMP 依赖性蛋白激酶(PKA)［3］在此过程中的可能作用。

1 材料与方法

1.1动物昆明种成年小鼠(♂，20～22g)，由兰州大学实验动物中心提供。

1.2试剂完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA;Sigma);PKA抑制剂H-89(Sigma);鼠抗GluR2抗体(Millipore Corporation，Temecula，CA，USA)，鼠抗β-actin抗体(江苏碧云天);辣根过氧化物(HRP)标记二抗(Jackson Immunoresearch Laboratories，Baltimore，PA，USA);ECL发光试剂盒(江苏碧云天)。

1.3疼痛模型制备［4］小鼠经乙醚浅麻醉后，后足底二、三趾之间的皮下推入CFA 25 μl，对照组在相同部位注射等容量的生理盐水。造模前、后进行行为学测试。

1.4行为学测试及鞘内给药［5］采用Up-Down法测定 Von Frey纤维 (Stoelting，Wood Dale，IL，USA)诱发的缩足阈值(PWT)。鞘内给药采用经皮直接注射法，动物经乙醚浅麻醉后，用25 μl的微量进样器于L5-L6棘突间隙经皮穿刺，以进针产生空洞感并伴随动物甩尾，作为针头进入蛛网膜下腔的标志，缓慢注射药物5 μl，对照组注射同等体积的生理盐水。

1.5亚细胞结构分离根据我们前期报道的方法［5］，动物经苯巴比妥钠 (30 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，行锥板切开术，分离L4-L5节段脊髓。在4℃细胞裂解缓冲液中制备匀浆。匀浆液经1 000×g离心10 min，取上清(S1);S1经10 000×g离心15 min，收集富含突触小体 (synaptosome)的沉淀P2;P2用含0.5%Triton X-100的细胞缓冲液裂解15 min后，32 000×g离心20 min，得到富含突触后致密质(PSD)的沉淀P3。以上操作均在4℃下进行。P3经重新悬浮后，加入4×样品缓冲液，煮沸5 min，进行Western blot检测。

1.6免疫印迹用8%SDS-PAGE电泳分离蛋白;转移到PVDF膜上;经5%脱脂奶粉室温封闭30 min后，以相应蛋白的抗体4℃孵育过夜;印迹膜经洗涤后，用HRP标记的二抗室温孵育1 h，以ECL发光试剂盒显像;以Image J软件进行图像分析。

1.7数据统计数据均以±s表示;采用One-way ANOVA、post-hoc Tukey HSD进行显著性检验。

2 结果

2.1CFA对小鼠缩足阈值的影响及其与PKA的关系行为学结果显示:注射CFA后24 h，小鼠的缩足阈值低于生理盐水对照组，提示机械性痛觉超敏的形成;此时，鞘内注射PKA抑制剂H-89，则明显提高炎性疼痛小鼠的缩足阈值，且其作用至少持续30 min(Fig 1)，提示PKA在炎性疼痛中的重要作用。

Fig 1 Effect of CFA on PWT of mice and its relation with PKA

2.2CFA对脊髓背角AMPA受体GluR2亚基突触表达的影响及其与PKA的关系为探讨AMPA受体在痛觉超敏中的作用，本试验在注射CFA后24 h，分离脊髓背角，提取富含PSD的亚细胞结构，检测AMPA受体GluR2亚基的突触表达，发现炎性疼痛组动物的GluR2突触含量升高，与生理盐水对照组相比，差异有显著性(Fig 2)。而在注射CFA后24 h，鞘内给予PKA抑制剂H-89处理脊髓30 min，发现H-89能降低GluR2的突触含量(Fig 2)，和CFA组动物相比较，差异有显著性。与炎性疼痛动物不同，正常小鼠鞘内注射H-89后30 min，动物的缩足阈值无变化(salinevsH-89:1.82±0.24 gvs1.72±0.15 g，P＞0.05，n=4);随后的免疫印迹实验也显示:H-89对正常小鼠GluR2的突触含量无影响(Fig 3)。这些实验结果提示:外周组织损伤，可能通过激活脊髓背角PKA，提高AMPA受体GluR2亚基的突触表达，从而参与痛觉超敏的形成。

Fig 2 Effect of CFA on synaptic content of GluR2 subunits and its relation with PKA.

3 讨论

AMPA受体介导痛觉信息从外周向中枢的传递，并在病理性疼痛的形成中发挥重要作用。抑制AMPA受体的活性，能够明显缓解外周组织或神经损伤诱发的痛觉超敏，而直接激动脊髓AMPA受体甚至在正常动物中也能诱发痛觉异常［6］。近年来大量的研究证实:突触后膜上AMPA受体的数目高度可变，这种动态变化是突触传递效率发生长时程改变的重要机制，并在学习、记忆以及许多神经系统疾病中扮演关键角色。然而，对于AMPA受体在慢性炎性疼痛中的突触表达变化，至目前为止尚存在很大争议。曾经有实验通过间接地检测胞质内AMPA受体的含量［2］，发现外周组织损伤可能调节脊髓背角GluR2亚基的内陷过程，影响AMPA受体的突触表达。而本实验直接提取富含突触后致密质(PSD)的亚细胞结构，测定炎性疼痛过程中GluR2的突触含量，发现CFA在诱发痛觉超敏的同时，能够明显提高脊髓GluR2的突触数目，说明痛觉超敏的形成与GluR2的突触聚集密切相关。GluR2亚基的突触表达增多，可能易化AMPA受体介导的痛觉信息的突触传递，从而导致慢性疼痛的形成。

Fig 3 Intrathecal application of PKA inhibitor H-89(2.5 μg)for 30 min generated minimal effects on the synaptic contents of GluR2 subunits in spinal dorsal horn of intact mice.

大量的实验显示:AMPA受体的突触输送过程，受到PKA、PKC(蛋白激酶C)等丝氨酸/苏氨酸激酶、以及蛋白酪氨酸激酶(PTKs)的调控。在AMPA受体的GluR1亚基中，包含有PKC和PKA的磷酸化位点(分别为第831位丝氨酸和第845位丝氨酸)，PKC/PKA对GluR1的催化磷酸化，能够提高GluR1在细胞膜表面及突触中的表达，增强兴奋性谷氨酸能突触传递［7-8］。而在GluR2亚基的胞质C-末端，则包含有多个酪氨酸的磷酸化位点;Src家族酪氨酸激酶(SFKs)对GluR2的磷酸化，能够调节GluR2与PDZ蛋白(如PICK1、GRIP1/2等)的结合，影响GluR2的内陷过程，从而调节GluR2的突触表达水平［9］。本文研究结果显示:抑制PKA的活性，能够明显拮抗组织损伤诱发的GluR2亚基的突触异常表达，且这一过程与炎性疼痛的缓解密切相关，提示脊髓PKA可能是促进GluR2向突触聚集的关键分子。而且我们的前期研究也显示:PKA能够激活脊髓背角Src家族酪氨酸激酶成员Fyn，参与脊髓背角痛觉信息的整合与调制［10］。因此，我们推测:PKA对GluR2突触表达的调节，可能与Src家族酪氨酸激酶有关。但其具体的机制尚有待于进一步的深入研究。

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