Caspase-3在骨髓间充质干细胞回输脑缺血再灌注模型大鼠脑组织中的表达

李梅笑 李 卓 邹立华 吴 军 (深圳市龙岗区人民医院，广东 深圳 58000)

脑出血可造成中枢神经系统损伤，损伤后的神经再生及功能恢复备受关注。骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells，MSCs)以多向分化、分泌营养因子、免疫原性弱并可透过血脑屏障在病灶定居等优点，成为治疗脑血管疾病的有效方法〔1～3〕。

1 材料与方法

1.1 动物 Wistar大鼠60只，清洁级，体重(270±20)g;Wistar大鼠乳鼠5只，清洁级，体重(10±2)g，由吉林大学实验动物中心提供。将大鼠随机分为正常对照组、模型组及MSCs治疗组，每组20只。

1.2 试剂与仪器 DMEM培养基(GIBCO公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒(TAKARA公司)、倒置显微镜(Olympus公司)、PCR仪(eppendorf公司)、凝胶成像系统(伯乐公司)

1.3 MSCs的分离、培养 无菌分离Wistar大鼠乳鼠股骨，取出骨髓，制备成单细胞悬液，以1×105/ml接种于培养瓶中，当细胞长至80%进行传代，传至3～6代备用。

1.4 MSCs诱导神经样细胞 选用第3代的MSCs，调细胞浓度为5×105/ml，接种到铺有盖片的6孔板中，12 h后更换培养基 DMEM/F12(含 2%B27，EGF 40 ng/ml，bFGF 20 ng/ml)，倒置显微镜观察细胞形态变化和生长状况，每隔2 d半量换液1次，7 d后固定细胞。免疫组织化学染色检测NSE表达。

1.5 大脑中动脉MCAO/再灌注模型的制备 根据Longa等报道方法〔4〕，结合朱继等改良的线栓法建立大鼠右侧MCAO/再灌注模型〔5〕。采用3.5%水合氯醛进行腹腔注射麻醉，固定动物，呈仰卧位，颈部皮肤消毒，经颈部正中切口，分离肌肉和筋膜，暴露右侧的颈总动脉 (CCA)、颈外动脉 (ECA)和颈内动脉 (ICA)，动脉夹夹闭ICA和ECA，小剪刀在颈外动脉残端做一切口，将预先准备好的栓线 (表面涂有肝素)从ECA缓慢插入ICA，去除ICA处的动脉夹，用直镊子将栓线缓慢沿ICA的入颅方向推进，在渔线进入约18～20 mm处微感到阻力时，栓线已经通过大脑中动脉的起始部，完成一侧大脑中动脉的阻塞。移除动脉夹，清理术野，全层缝合伤口。栓塞大脑中动脉2 h后打开手术切口，轻轻拔出线栓，待栓头到达分叉处停止，实施再灌注，清理术野，关闭手术切口。

1.6 RT-PCR方法检测caspase-3 mRNA的表达 模型大鼠制备成功后2 h，MSCs治疗组经大鼠尾静脉回输于模型组大鼠，细胞浓度为1×106/ml，回输1 ml，24 h后再回输一次，回输第7天，断头取脑，使用RNA提取试剂盒提取总RNA，根据GenBank上登陆的caspase-3基因序列，以β-actin为内参照，设计、合成引物。β-actin上游引物:5'GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT 3'，下游引物:5'AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT 3'，片段大小为147 bp;caspase-3上游序列:5'CTGGACTGCGGTATTGAG 3'，下游序列:5'AATCAAATCCGATGTTCC 3'，片段大小为489 bp。进行RT-PCR反应，1%琼脂糖凝胶电泳。

2 结果

2.1 免疫组化检测MSCs诱导神经样细胞NSE表达 MSCs加入诱导液后，倒置显微镜观察6 h后细胞形态无明显变化，24 h后可见部分细胞突起，7 d后细胞变成多角形、锥形，类似神经样细胞形态(见图1)，神经细胞球免疫细胞化学染色呈NSE阳性表达;而MSCs未诱导的神经样细胞呈NSE阴性表达。见图2。

2.2 RT-PCR方法检测caspase-3 mRNA的表达 治疗组caspase-3表达明显低于模型组(P＜0.05)。治疗组caspase-3表达接近于对照组(P＞0.05)。见图3、图4。

图1 显微镜观察MSCs诱导神经样细胞(×100)

图2 MSCs诱导神经样细胞NSE表达(×200)

图3 RT-PCR检测caspase-3 mRNA在MSCs回输脑缺血再灌注大鼠中表达

图4 RT-PCR检测β-actin在MSCs回输脑缺血再灌注大鼠中mRNA表达

3 讨论

在缺血脑组织的不同部位可见神经细胞凋亡〔6，7〕。caspase家族在凋亡过程中起重要作用，凋亡的最后过程是通过caspase的激活而实现的。活化的caspase通过酶解不同的底物蛋白产生不同的生物效应:(1)对凋亡抑制因子进行灭活;(2)破坏细胞结构;(3)通过分离蛋白的催化及调控功能区使其获得或失去一定的功能，从而进一步调控相关的下游事件，如细胞皱缩、膜发疱、染色质聚集、DNA片断化等，导致凋亡的典型形态学改变。各种引起凋亡的因素，如Fas死亡因子、肿瘤坏死因子、P53等均需要激活caspase-3才能导致细胞凋亡。MSCs可随血液循环到达全身其他器官组织，参与生理更新和病理损伤修复。MSC可分化为神经样细胞〔8〕，可以取代已经死亡的神经细胞。脑梗死后神经再生及神经功能恢复与病灶区及病灶周围的血管发生、重塑密切相关〔9〕。MSCs能分泌脑源性神经营养因子、神经生长因子、血管内皮生长因子、肝细胞生长因子等，对神经功能的恢复发挥重要作用。MSCs与神经干细胞共培养，MSCs能诱导神经干细胞分化为神经元。本实验成功地将MSCs诱导为神经样细胞。MSCs回输脑缺血再灌注模型大鼠后caspase-3基因下调，抑制神经细胞凋亡。治疗组caspase-3表达明显低于模型组，具有统计学意义。治疗组caspase-3表达接近于对照组。由于MSCs具有体外培养扩增比较容易且免疫原性小的优点，异体移植可修复损伤的组织或治疗相应组织病变，为脑缺血治疗理想的种子细胞。

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3 Jin JD，Wang HX，Xiao FJ，et al.A novel rich source of human mesenchymal stem cells from the debris of bone marrow samples〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2008;376(1):191-5.

4 Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats〔J〕.Stroke，1989;20:84-91.

5 朱 继，万 东，唐文渊.改良线栓法制备大鼠局灶脑缺血模型〔J〕.第四军医大学学报，2008;29(8):685-7.

6 Niwa M，Hara A，Iwai T，et al.Caspase activation as an apoptotic evidence in the gerbil hippocampal CA1 pyramidal cells following transient forebrain ischemia〔J〕.Neurosci Lett，2001;300(2):103-4.

7 Namura S，Zhu J，Fink K，et al.Activation and cleavage of caspase-3 in apoptosis induced by experimental cerebral ischemia〔J〕.J Neurosci，1998;18(10):3659-60.

8 Chao YX，He BP，Cao Q，et al.Protein aggregate containing neuron like cells are differentiated from bone marrow mesenchymal stem cells from mice with neurofilament light subunit gene deficiency〔J〕.Neurosci Lett，2007;417:240-5.

9 Toyama K，Honmou O，Harada K，et al.Therapeutic benefits of angiogenetic gene-modified human mesenchymal stem cells after cerebral ischemia〔J〕.Exp Neurol，2009;216:47-55.